ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ КРИПТОНА В КАЧЕСТВЕ РАБОЧЕГО ТЕЛА ДЛЯ ГАЗОПЛАЗМЕННОЙ КОАГУЛЯЦИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

На протяжении десятилетий хирурги используют различные способы физического воздействия на ткани для их коагуляции. Способ аргоноплазменной коагуляции (АПК), запатентованный в 1977 году, позволил существенно повысить эффективность гемостаза на обширных кровоточащих поверхностях паренхиматозных и полых органов в хирургии, эндоскопии, оперативном акушерстве. АПК активно применяется для остановки и профилактики кровотечения при резекциях печени, лѐгкого, поджелудочной железы, а также в ходе кесарева сечения или органосохраняющей миомэктомии [1, 2, 4, 5, 10]. Кроме того, АПК применяется в целях эндоскопического гемостаза при кровотечениях из опухолевой ткани, язвы желудка или двенадцатиперстной кишки, из варикозно-расширенных вен пищевода [6].

АПК – один из методов высокочастотной хирургии,  при использовании которого энергия электромагнитного поля высокой частоты передаѐтся на ткани бесконтактным способом в потоке ионизированного газа аргона, образующего факел, т.е. по рабочему телу. Под воздействием плазмы происходит локальный нагрев и коагуляция тканей. Кровь и другие жидкости, попавшие в зону воздействия, «выдуваются» при использовании АПК, что позволяет лучше контролировать процесс коагуляции, дополнительно улучшая при этом результат. Поскольку происходит поверхностное высушивание обрабатываемого участка ткани и образование струпа, то его электрическое сопротивление возрастает, а факел аргоновой плазмы отклоняется на близлежащие участки ткани с наименьшим сопротивлением, в результате чего происходит равномерная коагуляция всей зоны воздействия. Глубина коагуляционных изменений не превышает трѐх миллиметров, что зависит от длительности воздействия, типа ткани и др. Перегрева и карбонизации тканей не происходит, т.к. струя инертного газа аргона, препятствующего горению, вытесняет кислород над обрабатываемым участком ткани [4, 7, 8, 9].

Несмотря на очевидные преимущества, достигнутые при использовании АПК, по-прежнему актуальны проблемы дальнейшего повышения эффективности гемостаза, сокращения продолжительности операции, уменьшения толщины зоны термического некроза, сокращения сроков регенерации тканей и времени послеоперационной реабилитации пациентов. [3]. В литературе нет упоминаний о возможности использования других инертных газов в качестве рабочего тела для ГПК, кроме широко применяемого аргона в виду низкой стоимости последнего. (Табл.1).

 

Характеристика инертных газов

Таблица 1

 

Рабочее тело	Атомная масса	Радиус ионов	Энергия ионизации	Распространѐн-ность в атмосфере	Примерная стоимость
	(а.е.м.)	(пм)	(эВ)	по объѐму (%)	(руб./л)
Не (гелий)	4,00	93	24,47	0,000524	1
Ne (неон)	20,18	112	21,51	0,001818	25
Ar (аргон)	39,95	154	15,75	0,934	1
Kr (криптон)	83,8	169	13,99	0,000114	100
Хе (ксенон)	131,29	190	12	0,0000087	1000

 

Для нашего исследования в качестве рабочего тела для ГПК среди ряда инертных газов был выбран криптон. Он обладает бόльшей атомной массой, бόльшим радиусом иона, мéньшей энергией ионизации, чем широко применяемый в медицине аргон. Кроме того, криптон относительно доступен по сравнению со следующими газами данной группы.

Цель работы: экспериментальное обоснование принципиальной возможности, безопасности и эффективности использования криптона в качестве рабочего тела для газоплазменной коагуляции (ГПК).

Материал и методы

На предварительном этапе были проведены эксперименты in vitro на препаратах свиной печени с использованием в качестве рабочего тела для ГПК аргона и криптона. Свиная печень располагалась на пластине НЭ поверх диэлектрической рабочей поверхности. С помощью разработанного ЭХК, на печень наносились ожоги посредством ГПК с использованием аргона и криптона, эффект газоплазменного воздействия на обрабатываемую поверхность оценивался макроскопически, измерялась глубина и площадь коагцляции. Кроме того, на данном этапе сравнивались различные сочетания таких параметров работы ЭХК, как мощность, скорость газоподачи, дистанция рукоятки активного электрода до коагулируемой поверхности, экспозиция.

На первом этапе проводилась серия острых и хронических экспериментов на 40 лабораторных крысах, 20 крыс в основной, в 20 крыс в группе контроля. Животным из группы контроля в гемостатических целях выполнялась АПК, а животным из основной группы - КПК. В условиях экспериментальной операционной под общим севорановым наркозом производилась верхнесрединная лапаротомия. После краевого повреждения стандартизированным цилиндрическим пробойником диаметром 5 мм печень подвергалась газоплазменному воздействию в основной группе с применением КПК, в группе контроля – АПК. При этом использовались сочетание параметров воздействия, определенные in vitro. Критерием прекращения воздействия было достижение полного гемостаза. Фиксировалось время этапа коагуляции, объем газа, использованного в ходе вмешательства. Рассчитывалась энергия, затраченная для достижения гемостаза по формуле E = N × t, где E – энерговклад (Дж), N – выдаваемая мощность ЭХК (Вт), t – время (сек).

Производился забор материала с помощью стандартизированного цилиндрического инструмента диаметром 10 мм в момент операции и при проведении релапаротомии на 1-е, 3-е, 7-е, 14-е и 30-е сутки.

На втором этапе проводилась серия острых и хронических экспериментов in vivo на 20 поросятах с одинаковыми гендерными и зоометрическими параметрами.

В условиях нейроаксиальной блокады, седации пропофолом в экспериментальной операционной выполнялась верхнесрединная лапаротомия электротомом. Стандартизированным цилиндрическим инструментом диаметром 10 мм наносились 10 одинаковых краевых повреждений печени каждого животного, 5 из которых в последствии подвергались АПК (1-я группа фрагментов тканей печени), а остальные 5 - КПК (2-я группа фрагментов тканей печени) до достижения полного гемо- и холестаза. Воздействие на печень осуществлялось с помощью оригинального экспериментального электрохирургического комплекса, специально разработанного фирмой ООО «ЭФА медика» под поставленные задачи.

Для гистологического исследования материал забирался с помощью стандартизированного цилиндрического инструмента диаметром 15 мм в момент операции и при проведении релапаротомии на 1-е, 3-е, 7-е, 14-е и 30-е сутки.

Для патоморфологического исследования подготовленных препаратов использовали обзорные (рутинные) методики: окраска гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону. Применялись наиболее перспективные гистохимические методы для изучения клеточных и межклеточных компонентов соединительной ткани, сосудов и нервов, особенностей ангио- и фибриллогенеза. Проводили иммуногистохимические исследования с CD-маркерами, а также морфостатистическое исследование клеточного состава демаркационного воспалительного инфильтрата и ангиогенеза.

Полученные результаты

В ходе эксперимента in vitro выяснилось, что криптон принципиально может быть использован в качестве рабочего тела для газоплазменной коагуляции, т.к. поддерживает стойкий факел плазмы. При равных условиях очаги коагуляционного некроза после АПК и КПК в экспериментах in vitro макроскопически не отличаются, имеют одинаковую глубину проникновения и площадь. Оптимальным сочетанием параметров для дальнейших экспериментальных исследований эмпирически определены следующие параметры:

-   скорость газоподачи - 4 л/мин;

-   выводимая мощность - 5 Вт для крыс и 20 Вт для поросят;

-   дистанция от кончика рукоятки до коагулируемой ткани - 10 мм.

Отсутствие значимых различий макроскопической картины воздействия КПК и АПК на ткань печени на этом этапе исследования нас не остановило от выполнения экспериментов in vivo. Мы допустили, что при сохранении кровотока полученные результаты могут оказаться иными.

В ходе экспериментов in vivo на крысах получены следующие результаты. После нанесения стандартизированной краевой раны печени производилась ГПК, при этом рана покрывалась серебристой плѐнкой, в ряде случаев, точечное кровотечение возобновлялось, что требовало повторной электрохирургической обработки раны факелом плазмы. Отмечено, что при КПК чаще удавалось коагулировать рану печени за один подход. При АПК зачастую требовалось 2-3-4 подхода, что удлиняло время этапа коагуляции. Таким образом, гемостаз при КПК достигался в среднем в 1,38 раз быстрее, чем при использовании АПК. Время воздействия КПК составило 6,64±0,29 сек против 9,17 ± 0,49 сек при АПК. Энерговклад при этом составил для АПК 45,83±2,45 Дж за операцию, а для КПК - 33,2±1,45 Дж (Рисунок 1)

При микроскопическом исследовании ткани печени крыс и свиней из зоны раневой поверхности, подверженной электрохирургическому воздействию в двух режимах ГПК, усиленной аргоном и криптоном, во всех экспериментальных наблюдениях выявили однотипную тканевую реакцию.

Через 30 минут после электрохирургического воздействия в области дна раны обнаружены скопления деформированных пикноморфных клеток, разделенных между собой полостями различного размера. Встречались участки бесструктурного оксифильного уплотненного некротического детрита.

Однако толщина зоны указанных изменений  существенно разнилась (Рисунок 2) и  зависела от вида использованного инертного газа: аргон (1-я группа) – 2,2±0,3 мм, криптон (2-я группа) – 0,6±0,1 мм. Кроме того, в первой группе встречались мелкие очаги дегидратированных обуглившихся структур, как проявления прямого коагуляционного некроза. Все виды некробиотических и некротических изменений были слабо отграничены от сохранившейся ткани печени узкой зоной лейкоцитарной демаркации. Инфильтрат, отделяющий некротизированные ткани, состоял из редко расположенных полиморфноядерных лейкоцитов, объемная плотность которых при морфологическом исследовании составила в 1-й группе - 12,3±1,9, во 2-й группе - 6,1±1,1 соответственно.

На границе прямого термического некроза и сохранившейся ткани печени были видны очаговые, преимущественно перикапилярные диапедезные кровоизлияния. Раневая поверхность при обоих видах воздействия на значительной площади была покрыта тонким струпом, состоявшим из эритроцитов, лейкоцитов и десквамированных гепатоцитов. Его толщина варьировалась в пределах 2,1±0,3 мм в 1-й группе и 0,2±0,02 мм во 2-й группе соответственно.

Следует добавить, что при использовании АПК (1-я группа), в подлежащих участках печеночной ткани на глубине 2-4 печеночных долек от раневой поверхности отмечена эктазия печеночных вен, явления гидропической дистрофии паренхимы, умеренный отек соединительно-тканных прослоек и периферические диапидезные кровоизлияния (Рисунок 3). При использовании КПК (2-я группа) эти изменения отсутствовали или были незначительными.

В просвете отдельных сосудов, прилежащих к зоне некротических изменений, отмечены явления стаза эритроцитов и даже обтурирующие фибриновые и смешанные тромбы. Кроме того, выявлена дегрануляция тканевых базофилов, периваскулярный отек, разволокнение и набухание фибриллярных структур. Встречались мелкие очаги кровоизлияний.

Через сутки менялся состав демаркационного инфильтрата. Некротический струп, сформированный на поверхности раны, сохранял прежнюю структуру и был представлен слоем резко деформированных пикноморфных клеток, полостями различного диаметра, некротизированными тканевыми фрагментами. Под струпом, в отдельных участках, отмечен тонкий слой фибринозного выпота, отличавшийся выраженной ШИК- позитивной реакцией. Полиморфноядерные лейкоциты отделяли зону некроза от сохранившейся ткани печени,

часть из которых отличалась признаками кариорексиса. Объемная плотность лейкоцитов на границе зоны некроза составила 18,3±1,6 при КПК и 47,6±2,3 при АПК соответственно.

Кроме того, при использовании АПК, уже через сутки в зоне демаркации появились моноциты и

макрофаги. За лейкоцитарным инфильтратом сохранялась зона вторичных дисциркуляторных изменений, которую, с нашей точки зрения, необходимо расценивать как своеобразную зону резерва некроза. Ее толщина не менялась через сутки после воздействия, вместе с тем, граница вторичных изменений с подлежащими жизнеспособными гепатоцитами была выражена более отчетливо.

На 3-и сутки после газоплазменного воздействия в обоих случаях, зона первичного некроза оставалась без изменений. Из зоны демаркационного инфильтрата лейкоциты по множественным щелям и стромальным прослойкам проникали в зону резерва некроза и некробиотических изменений. Среди лейкоцитов было отмечено обилие фигур кариорексиса. Демаркационный инфильтрат отличался клеточным полиморфизмом за счет присутствия моноцитов, фибробластов. За счет этого объемная плотность полиморфноядерных лейкоцитов уменьшилась вдвое через 72 часа, независимо от вида воздействия. Изменение качественного состава клеток инфильтрата на поле демаркационного воспаления указывало на то, что воспалительная реакция вступила в свою макрофагальную фазу с начальными признаками активации пролиферативных изменений и ангиогенеза. Добавим, что в капиллярах и венулах, набухание эндотелиоцитов сопровождалось их пролиферативными изменениями. В отдельных полях зрения отмечено образование  своеобразных «капиллярных почек» во 2-й группе.

Суммарная зона некротических изменений на 7-е сутки увеличилась и уплотнилась за счет слияния зоны первичного некроза и зоны резерва некроза, независимо от вида газо-плазменного воздействия. И составила при использовании КПК 1,4±0,2 мм и 6,4±0,4 мм при АПК соответственно.

На данном экспериментальном сроке некротические изменения были отграничены от зоны жизнеспособных гепатоцитов формирующейся молодой грануляционной тканью, которая была представлена хаотичным разрастанием гемокапилляров и клетками гистеогенного и гематогенного происхождения. При этом пораженная ткань приобретала черты круглоклеточного инфильтрата, в котором преобладали макрофаги, лимфоциты, плазмоциты, молодые фибробласты, единичные клетки Мотта. Процесс сопровождался активным фибриллогенезом, синтезом коллагена и протеогликанов матрикса. На поле воспаления появились многочисленные гигантские многоядерные клетки, имеющие макрофагальное происхождение и образующиеся в результате слияния эпителиоидно-клеточных элементов.

В отдельных полях зрения демаркационное воспаление приобретало черты гранулематозного, а плотность инфильтрата была более выраженой при применении АПК (в 1-й группе). По-прежнему сохранялись диапедезные кровоизлияния разной давности, отложения гемосидерина.

В отдельных полях зрения молодая грануляционная ткань приобретала морфологические черты молодой рубцовой ткани за счет направленного фибриллогенеза и продольного направления пучков молодых коллагеновых волокон. Ориентирование фибробластов в рубце совпадало с пучками коллагеновых волокон. Объемная плотность капилляров на данном экспериментальном сроке в 1-й и 2-й группах составила 3,9±0,3 и 2,2±0,4 соответственно.

Отмечены  многочисленные контакты фибробластов с лимфоцитами за счет погружения последних в«седловидную» инвагинацию фибробласта (эффект активирования фибробласта и усиленного синтеза коллагена).

Среди активированных фибробластов отмечены нормальные фигуры кариокинеза. Участки формирования молодой волокнистой рубцовой ткани не имели признаков ремоделирования рубца.

На 14 сутки струп, покрывающий рану, был сильно фрагментирован, вокруг его отдельных элементов формировались очаги гранулематозного воспаления. В гранулемах сохранялось значительное количество многоядерных гигантских клеток макрофагального ряда (Рисунок  4), количество которых при АПК кратно превышало количество аналогичных элементов при воздействии КПК (27,6±2,1 и 10,3±1,7 соответственно). Такие модифицированные макрофаги активно участвовали в резорбции мумифицированных элементов в зоне некроза, обугленных частиц, гемосидерина и т.д. Объемная плотность грануляционной ткани и ее зрелость усиливались, сохранялось обилие контактов фибробластов и лимфоцитов, при которых последние приобретали новые морфологические особенности: компактное гиперхромное ядро и узкую просветленную цитоплазму.

Грануляционная ткань выглядела более зрелой за счет образованных гемокапилляров, значительная часть которых находилась в спавшемся состоянии и имела вид фиброзно-клеточных тяжей, лишенных просвета. Фактически объемная плотность действующих капилляров по сравнению с 7 днем наблюдения при АПК сократилось вдвое, а при КПК втрое, и составила 2,1±0,5 и 0,8±0,3 соответственно.

На 30 сутки продолжало меняться количественное отношение клеток инфильтрата: уменьшение числа макрофагов сопровождалось выраженным ростом объемной плотности лимфоцитов и фибробластов, среди последних увеличивались в объеме пучки коллагеновых волокон, которые обладали выраженной ШИК- позитивной реакцией, а по Маллори-Мартинсу окрашивались в голубой цвет. Поверхность зоны газоплазменного воздействия была покрыта сформированной нежной рубцовой тканью различной толщины: при АПК 3,4±0,8 мм, при КПК 0,9±0,2мм. Следует добавить, что при использовании криптона рубец отличался отчетливыми признаками зрелости и ремоделирования (Рисунок 5).

Обсуждение

Поиск факторов, благодаря которым микроскопическая картина после КПК существенно лучше, чем после АПК, представляет отдельный интерес, но остается за рамками данной научной работы. Однако, следует заметить, что отсутствуют значимые различия коагуляционного воздействия КПК и АПК на ткани печени in vitro при значительном увеличении эффективности КПК в сравнении с АПК в экспериментах in vivo. По-видимому, эффекты воздействия  криптоновой плазмы достигаются при условии функционирования систем гомеостаза. Необходимы дальнейшие исследования, которые бы определили факторы эффективности КПК.

В ходе исследования все животные выводились из эксперимента точно в срок, витальные функции изменялись в соответствии со стандартным течением послеоперационного процесса. Осложнений и летальных исходов во всех группах отмечено не было. Это свидетельствует о безопасности метода криптоноплазменной коагуляции. Полученные результаты позволяют перейти к этапу клинических исследований.

Выводы:

1.     Использование криптона в качестве рабочего тела для газоплазменной коагуляции не только принципиально возможно, но и безопасно и эффективно.

2.     В ходе криптоноплазменной коагуляции гемостаз травмированной печени животных достигается быстрее, энерговклад при этом ниже в сравнении с аналогичными результатами аргоноплазменной коагуляции.

3.     При использовании криптоноплазменной коагуляции отмечается значительное ускорение течения раневого процесса с формированием более нежного ремоделированного рубца.

 

Список литературы

1.     Бондаревский И.Я., Гринчий Д.Е. Аргонусиленная коагуляция и высокоинтенсивное лазерное излучение в хирургии печени // Фундаментальные исследования. – 2011. - №10. – С. 485-487

2.     Гаспаров А.С., Бурлев В.А., Дубинская Е.Д. и др. Эффективность применения аргоноплазменной коагуляции в акушерстве и гинекологии // Российский вестник акушера-гинеколога. – 2011. – № 2. – С. 33- 36.

3.     Голубев А.А., Шепель Е.В., Ситкин С.И. и др. Экспериментальное обоснование применения инертного газа криптон для газоплазменной коагуляции // Хирургическая практика – 2013. - № 2. - С. 34-38

4.     Елькин А.В., Кобак М.Э., Попова Е.А. и др. Опыт применения экзогенного монооксида азота и аргоноплазменной коагуляции при кавернотомии у больных фиброзно-кавернозным туберкулезом легких с наличием множественной лекарственной устойчивости // Пробл туб и бол легких - 2008. - №8. - С. 42-44.

5.     Майстренко Н.А., ЮшкинА.С., Курыгин А.А. Физические способы диссекции и коагуляции тканей в абдоминальной хирургии. - СПб.: Наука, 2004. 115 с.

6.     Машкин А.А., Хойрыш А.А., Ефанов А.В., Федосеева Н.Н. Применение эндоскопической аргонно- плазменной коагуляции в лечении больных с острыми желудочно-кишечными и пищеводными кровотечениями различной этиологии: Пособие для врачей. – Тюмень, 2007. – С. 7–11.

7.     Оленева М.А., Есипова Л.Н., Вученович Ю.Д. Аргоноплазменная коагуляция тканей при кесаревом сечении // Status Praesens - 2010. - Т.2, № 4. - С. 61—64.

8.     Пряхин А.Н. Высокоинтенсивное лазерное излучение в лапароскопической гепатобилиарной хирургии // Анналы хирургической гепатологии. - 2006. - Т. 11, № 4. - С. 38-43.

9.     Тимербулатов В.М., Плечев В.В., Хасанов А.Г. Современные методы рассечения и коагуляции тканей в хирургии органов брюшной полости - М.: МЕДпресс-информ, 2007. - 174 с.

10. Weber J.C. New technique for liver resection using heat coagulative necrosis / J.C. Weber, G. Navarra, L.R. Jiao,

J.P. Nicholls // Annals of surgery. - 2002. - Vol. 236, № 5 - P. 560-563.