08 марта 2016г.
Ежегодно в Республике Татарстан более 200 человек погибает от утопления. При этом большая часть из них находиться в возрасте от 18 до 45 лет, преобладают мужчины иоколо 70% перед погружением в воду употребляли алкогольные напитки [4].
В качестве лабораторного метода исследования для диагностики утопления в судебной медицине России используется определение диатомовых водорослей в органах утонувших.Устойчивость к разрушающим факторам (продолжительное пребывание трупа в воде, воздействие агрессивных сред) створок диатомей позволяет обнаруживать ихв биологических тканях спустя длительное время после наступления смерти [1,2,3]. Однако,порезультатаманализа диатомового метода, примененного в медико-криминалистическом отделении ГАУЗ «Республиканское бюро судебно-медицинской экспертизы Министерства здравоохранения Республики Татарстан» (ГАУЗ «РБ СМЭ МЗ РТ»), диатомеи были выявлены в почках и костном мозге менее чем в 50% случаев. Данные судебно-медицинских экспертов г.Витебск ещѐ более низкие и составляют 23% [5]. В этой связи нам представляется необходимым поиск более результативных лабораторных методов. С этой целью для выявлениябиологических маркеров утопления нами был опробован масс-спектрометр MALDI BioTyper (BrukerDaltonik, Германия), позволяющий проводить идентификацию микроорганизмов методом определения белкового профиля клеток.
Материал и методы
Объектами исследования были кровь из левой половины сердца, кровь из правой половины сердца, кровь из бедренной вены трупа, вода из водоема, в котором находилось тело умершего. Кровь и воду набирали стерильными одноразовыми шприцамина 2 мл. Дальнейшее исследование проводили на базе Междисциплинарного Центра Протеомных Исследований, Казанского (Приволжского) федерального университета. Из доставленного объема крови (или воды) отбирали 20-40 мкли помещали в 3-4 мл питательной среды Luria-Bertani(LB)и/или Кинга Б. Культивирование проводили в пробирках в течение 16-18 часов при комнатной температуре или в инкубационном шкафу при температуре +28°Cи интенсивности качания 50-70 об/мин. Для получения изолированных колоний стерильной петлей небольшое количество материала рассевали штриховыми движениями на твердой питательной среде LB и/или Кинга Б. Чашки инкубировали в термостате при оптимальной температуре (+28°C) в течение 12 ч.
Состав питательной среды LB на 1 л: 10 гтриптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 гNaCl. Твердая питательная среда LB дополнительно содержала15 гагара. Состав питательной среды Кинга Бна 1 л: 20 г пептона, 1.9 г K2HPO4´3H2O, 2.8 г MgSO4´7H2O, 8 мл 100% глицерина. Твердая питательная среда Кинга Бдополнительно содержала 15 гагара.
Изолированные колонии, выросшие на поверхности агара, изучали визуально, обращали внимание на величину, форму, цвет, характер краев и поверхности колоний, их консистенцию и другие отличительные признаки. Далее проводили анализ по стандартной методике: до 10 единичных колоний с каждой чашки наносили на мишень прибора microflexMaldiBioTyper(BrukerDaltonics, Германия). На образец наслаивали 1 мкл раствора матрицы (α-циано-4-гидроксикоричная кислота). После высыхания, мишень с образцами помещали в прибор - настольную MALDI-TOF систему microflexMaldiBioTyper и получали спектры константных белков неизвестных микроорганизмов.
Масс-спектрометрический анализ проводили с использованием программного обеспечения MALDI Biotyper 3.1 (BrukerDaltonics, Германия). В соответствии с требованиями производителя, достоверным считали видовую/родовую идентификацию микроорганизмов, при которой уровень совпадения полученного ряда константных белков (score) неизвестных микроорганизмов с базой данных находился в пределах 1.7-3.0. При этом значения 1.70 - 2.29 свидетельствовали о положительном определении рода, значения 2.30 - 3.00 – о надѐжном определении вида.
Результаты и обсуждение
В настоящей работе, первостепенное значение для диагностики утопления имели те виды микроорганизмов, которые были выявлены и в образце воды из водоема, из которого был извлечен труп, и в анализируемой крови. В ходе исследования в левом предсердии и бедренной вене с высокой точностью (score ≥ 2.2) были обнаружены бактерии родов Aeromonas и Acinetobacter. Эти бактерии не входят в состав нормальной микрофлоры человека (но входят в состав микробиоты кожи) и могут попасть в кровяное русло только при аспирации воды или путем проникновения через раны. В контрольных образцах крови трупов, изъятых у труповвне водной среды, данные бактерии не были выявлены.
Выводы
Проведенные нами исследования доказывают возможность использования протеомного анализа с применением прибора MALDI BioTyper для диагностики утопления. Данный метод является удобным, достоверным и относительно быстрым (до 48 часов). Бактерии рода Aeromonas и Acinetobacter могут рассматриваться как маркеры для идентификации истинного утопления.
Список литературы
1. Гололобова М.А. Котов А.А. К вопросу об использовании «диатомового теста» для экспертной диагностики утопления. Теория и практика судебной экспертизы 2013; 2: 30: 174-181.
2. Марченко Н.П. Судебно-медицинское значение обнаружения планктона и псевдопланктона во внутренних органах при смерти от утопления / Н.П. Марченко; Материалы 3-й расширенной научной конференции, посвященной памяти заслуженного деятеля науки проф. М.И. Райского. – Киев, 1958. – С. 52-54.
3. Матышев А.А. Судебно-медицинская экспертиза механической асфиксии / А.А. Матышев, В.И. Витер. – Л.: Медицина, 1993. - 217 с.
4. Судебно-медицинская служба Республики Татарстан в 2013 году/сост.: В.А. Спиридонов, Н.В. Морозюк, Е.В. Чугунова [и др.] – Казань: Медицина, 2014.- 128 с.
5. Яблонский М.Ф. Анализ результатов исследований на диатомовый планктон при утоплении / М.Ф. Яблонский, В.М. Жолнеровский, А.А. Буйнов // Вестник Витебского Государственного медицинского университета, 2006. - Вып. 5. – С. 85-88.
