08 марта 2016г.
Полиморфизм генов, связанных с регуляцией сосудистого тонуса, определяет риск возникновения и дальнейшего развития артериальной гипертензии [1]. Одним из наиболее изученных генов этой группы является ген эндотелиальной NO-синтазы (NOS3), кодирующий фермент NO-синтазу 3 типа, под действием которого в клетках эндотелия сосудов синтезируется оксид азота (NO). Ген NOS3 картирован и секвенирован. К настоящему времени в данном гене выявлено 11 полиморфизмов, одним из которых является полиморфизм 894G>T (Glu298Asp) 7 экзона. В ряде работ [6 и др.], установлена ассоциация минорного аллеля Т894 с инфарктом миокарда и гипертонией, то есть наличие этого аллеля приводит к снижению продукции NO, тем самым нарушая баланс продукции эндотелиальных вазоактивных факторов и провоцируя развитие вазоконстрикции. При этом в доступной литературе мы не встретили данных об ассоциации полиморфизм 894G>T гена NOS3 с продукцией NO и эндотелина-1 (ЭТ-1) у практически здоровых лиц.
В связи с вышеизложенным, целью данной работы явилось изучение влияния полиморфизма 894G>T гена NOS 3 (rs1799983) на продукцию вазоактивных эндотелиальных факторов у практически здоровых лиц с различными типами гемодинамической реакции на нагрузку.
Материалы и методы. Всего обследовано 79 человек, постоянно проживающих в условиях Европейского Севера, из них 56 юношей и 23 девушки. Критерии включения в исследование: возраст 18-22 лет, отсутствие острых инфекционных и хронических соматических заболеваний. В исследование включались девушки с овуляторным нормопонирующим овариально-менструальным циклом в фолликулярную фазу. Критериями исключения из исследования явилось: наличие у обследуемых острых воспалительных заболеваний, хронических заболеваний внутренних органов, в том числе и в стадии стойкой ремиссии, ожирения. В изучаемую выборку не включались лица, имеющие регулярные (2-3 раза в неделю) физические нагрузки, так как систематические физические нагрузки динамического характера способствуют повышению эндотелий-зависимой релаксации сосудов [3].
У всех лиц было проведено молекулярно-генетическое исследование. ДНК выделяли из клеток крови при помощи набора реагентов «АмплиПрайм РИБО-преп» фирмы «ИнтерЛабСервис» (г. Москва). Генотипирование полиморфизма 894G>T в гене NOS3 проводили методом пиросеквенирования на приборе PyroMark Q24 с использованием комплекта реагентов «ТОНО-скрин» (профиль генетического исследования «Артериальная гипертензия») на базе лаборатории молекулярной иммунологии и сероэпидемиологии ФБУН «Санкт- Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера».
Оценку концентрации NO в сыворотке крови по суммарной концентрации стабильных метаболитов нитратов/нитритов проводили биохимическим методом с использованием набора «Total NO/Nitrite/Nitrate («R&D Systems», США)». Анализ плазменного содержания ЭТ-1 осуществляли методом ИФА с использованием диагностического набора «Enzyme immunoassay for the quantitative determination of human endothelin 1-21 («BIOMEDICA GRUPPE», Австрия)». Рассчитывали индекс соотношения вазодилататор NO/вазоконстриктор ЭТ-1 по концентрации этих факторов в крови. Данный индекс позволяет оценить баланс продукции вазоактивных эндотелиальных факторов [2].
Тонус сосудов оценивался по данным периферической реовазографии с использованием индекса периферического сопротивления сосудов (ИПС). Для записи реовазограммы использовали многофункциональный диагностический компьютерный комплекс «Диастом-01» (ГОСТ 15.013-94). Тонус сосудов фиксировался до и после пробы с дозированной физической нагрузкой по Мартине-Кушелевскому [4] с выделением типов реакции сердечно-сосудистой системы.
Все участники исследования подписывали информированное согласие. Исследование одобрено Этическим комитетом СГМУ.
Статистическую обработку результатов производили с помощью пакета программы «SPSS 17».
Нормальность распределения оценивали с помощью критерия Колгоморова-Смирнова и Шапиро-Уилка. В случае ненормального распределения результаты представляли в виде медианы (Ме) и первого и третьего квартилей (Q1 и Q3). Для попарного критерия использовали критерий Манна-Уитни. Критический уровень значимости (р) при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05.
В результате молекулярно-генетического исследования были определены все аллели и генотипы изучаемого полиморфизма 894G>T гена NOS3. Преобладающими генотипами являлись генотипы, содержащие дикий вариант изучаемого аллеля, а именно вариант G. Соотношение различных аллельных вариантов гена NOS 3 (GG, GT, TT) у юношей распределялось соответственно как – 46,4%, 51,8% и 1,8%, у девушек как – 43,5%, 47,8%, 8,7%. Таким образом, наиболее редким являлся генотип ТТ, что согласуется с общемировыми данными
Наличие в генотипе минорного аллеля Т приводит к снижению каталитической активности фермента в результате усиления его протеолиза, и соответственно к низкой продукции NO в тех ситуациях, когда локально необходимо его участие в регуляторных механизмах [5]. Однако в наших исследованиях разницы в уровне продукции оксида азота у лиц разных генотипов выявлено не было. Так, у юношей и девушек с генотипом GG медиана NO составила 20,53 мкмоль/л и 13,46 мкмоль/л соответственно. Наличие в генотипе аллеля Т не сопровождается снижением продукции NO (медиана составила 21,19 мкмоль/л у юношей и 16,02 мкмоль/л у девушек). Однако обращают на себя внимание статистически значимые ( р<0.05) гендерные отличия уровня NO. У юношей – нормальных гомозигот (GG) уровень NO был на 53,3% выше, чем у девушек с подобным генотипом, у гетерозигот - юношей на 32,4% выше, чем у гетерозигот – девушек.
У нормальных гомозигот по полиморфизму 894G>T выявлена тенденции к некоторому повышению уровня ЭТ-1 по сравнению с гетерозиготами и патологическими гомозиготами. Так, у юношей и девушек с генотипом GG медиана ЭТ-1 составила 0,4228 фмоль/мл и 1,000 фмоль/мл соответственно. Наличие в генотипе аллеля Т приводит к небольшому снижению продукции ЭТ-1 (медиана составила 0,4228 фмоль/мл у юношей и 0,9312 фмоль/мл у девушек). Таким образом, и в продукции вазоконстриктора ЭТ-1 выявлены гендерные особенности – у девушек уровень ЭТ-1 в 2,4 раза ( р<0.05) выше, чем у юношей.
Фоновые показатели индекса периферического сопротивления сосудов в покое значительно не различаются у всех обследованных вне зависимости от генотипа и соответствуют норме. Однако гипертоническая реакция на нагрузку чаще встречалась у юношей, чем у девушек (28,6% и 17,4% соответственно). В результате анализа данных, полученных при проведении нагрузочной пробы, не было выявлено взаимосвязи между генотипом по полиморфизму 894G>T, типом реакции на нагрузку и уровнем продукции NO.
В целом, полученные результаты не позволяют оценивать минорный аллель Т как значимый предиктор возникновения эндотелиальной дисфункции и формирования периферической вазоконстрикции у лиц молодого возраста.
Необходимо дальнейшее изучение генетической предрасположенности к формированию периферической вазоконстрикции с учетом гендерных особенностей.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Правительства Архангельской области регионального конкурса «Север» в рамках научного проекта №14-04-98823 «Ассоциации полиморфизмов в генах NOS3, EDN1, EDNRA, EDNRB с периферической вазоконстрикцией»
Список литературы
1. Куба А.А., Никонова Ю.М., Феликсова О.М., Хромова А.В., Бебякова Н.А., Ассоциация генетического полиморфизма гена эндотелиальной синтазы оксида азота с сердечно-сосудистой патологией // Современные проблемы науки и образования . 2015. №3 www.science-educacion.ru/123-17352
2. Лямина С.В., Лямина Н.П., Сенчихин В.Н., Додина К.А. Эндотелиальные биомаркеры — потенциальные индикаторы клинического течения артериальной гипертонии у пациентов молодого возраста // Артериальная гипертензия. 2010. Том 16. №3. С. 261-265
3. Осипенко А. Роль системы оксида азота в процессах адаптации организма к физическим нагрузкам// Наука в олимпийском спорте. 2014. №1. С.23-30
4. Спортивная медицина : нац. руководство / гл. ред. С. П. Миронов, Б. А. Поляев, Г. А. Макарова. - М. : ГЭОТАР-Медиа. 2013. 1184 с.
5. Drexler H. Endotelial dysfunction in human disease // J.Mol.Cel. Cardiol. 2009/ Vol 31. P. 51-60
6. Li, J., Cun Y., Tang W.R. et al. Association of eNOS gene polymorphisms with essential hypertension in the Han population in southwestern China // Genet Mol Res. 2011. №10(3). Р.2202–2212
