08 марта 2016г.
Введение
Бруцеллез один из самых важных бактериальных зоонозов в мире, который оказывает значительное влияние на эпидемиологическую и эпизоотологическую ситуацию по особо опасным заболеваниям общих для человека и животных. Возбудители бруцеллеза грамотрицательные палочки, входящие в род Brucella spp. Род представлен 10 видами из которых наиболее опасными для человека и домашних животных признаны B. melitensis, B. abortus, B. suis (Godfroid J.). Ежегодно в мире регистрируется более 500 тысяч новых случаев бруцеллеза людей (Gwida M.). Большая часть которых регистрируется в странах Средиземноморья, Ближнего Востока, Центральной Азии, Африки и Южной Америки (Pappas G.).
Казахстан расположен в центре Евразии, и считается эндемичной по бруцеллезу территорией с высоким уровнем инфицирования людей и животных. В бывшем Союзе в Казахстане ежегодно регистрировалось 4270 новых случаев бруцеллеза людей (Студенцов К.П.). Эпидемическая ситуация с бруцеллезом среди людей остается сложной и в настоящее время. К примеру, регистрация впервые выявленного бруцеллѐза составила: в 2006 году на 100 тыс. населения 17,5 (2670 случаев), в 2007 год – 14,7 (2278); в 2008 год – 16,4 (2577); в 2009 год - 13,3 (2110); в 2010 год – 13,3 (2153); в 2011 год – 10,9 (1800); в 2012 – 9,02 (1509); в 2013 – 8,49 (1443). При этом, заболеваемость в некоторых регионах достигает 62,7 случаев на 100 тыс. населения (Grushina T.).
В Казахстане большинство случаев заболевания людей бруцеллезом вызваны B. melitensis. (Mizanbayeva S.). Основные очаги данного возбудителя находятся в Южном Казахстане (Жамбылская, Южно-Казахстанская и Алматинская области) на долю этих областей приходится более 50% поголовья мелкого рогатого скота (http://www.stat.gov.kz). Кроме того, 77% неблагополучных пунктов по бруцеллезу мелкого рогатого скота также приходится на данные регионы (Сансызбаев А.Р. и др., 2013).
Сансызбаев А.Р. и др. Анализ ситуации по бруцеллезу животных в мире и Казахстане. Ветеринария. 2013. - №5. - С.52-60
Инфицированные домашние и дикие животные являются естественным резервуаром и источником заражения людей через прямой контакт или при употреблении животноводческой продукции (Ravanela N.). В связи с этим, важное значение в ликвидации бруцеллеза играет контроль эпизоотического благополучия животных включая контроль перемещения животных из неблагополучных по бруцеллезу регионов. Современные молекулярно- генетические методы позволяют проводить «дактилоскопию» возбудителей инфекционных заболеваний с возможностью дальнейшего определения источника инфекции. Для генетической «дактилоскопии» бруцелл хорошо зарекомендовал анализ множественных тандемных повторов (MLVA). Набор тандемных повторов включает в себя 8 минисателитных повторов для видовой идентификации и 8 микросателитных повторов для дальнейшей дифференциации (Al Dahouk S.). Несмотря на высокий уровень распространенности бруцеллеза в Казахстане, в литературе и базах данных отсутствует информация о генетическом разнообразии штаммов, циркулирующих в стране, также не проводится отслеживание вспышек и путей распространения бруцеллеза. Поэтому целью нашего исследования являлось MLVA анализ штаммов B. melitensis, выделенных из регионов страны с максимальным уровнем распространения бруцелл.
Материалы и методы
В работе было использовано 128 штаммов бруцелл. Все штаммы были собраны от сероположительных животных, выявленных в период плановых исследований на бруцеллез 2007 по 2013 гг. Первичное выделение изолятов было осуществлено на основе питательного агара для бруцелл (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd. Munbai. India) с добавлением 10% лошадиной сыворотки (Sigma. USA) и селективной добавки (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd. Munbai. India). ДНК выделяли из 48 часовых культур инактивированных хлороформом, методом фенол хлороформной экстракции (Wilson K.). Чистота штаммов на контаминацию посторонней микрофлорой и родовая принадлежность была оценена методом анализа нуклеотидной последовательности 16S rRNA гена. Видовая принадлежность подтверждена мультиплексным ПЦР «Bruce-ladder PCR».
MLVA генотипирование.
MLVA генотипирование было осуществлено с использованием мультиплексного ПЦР и капиллярного электрофореза как описано ранее Garofolo G. с соавторами (Garofolo G.) с модификациями. Реакционная смесь содержала 6 пмоль каждого праймера; 75 мМ Tris-HCl (pH 8,8 при 25°С); 20 мМ (NH4)2SO4; 0,01% Твин 20; 2,5 mM MgCl2 для мультиплексной системы 1, 2,0 mM MgCl2 для мультиплексной системы 2 и 3,0 mM MgCl2 для мультиплексной системы 3 и 4; дНТФ 200 нM каждого; 5 % DMSO; смесь Taq и Pfu полимеразы в соотношении 1,9 Ед. : 0,1 Ед. соответственно; 10 нг ДНК. Капилярное разделение проводили на ABI3730xl, используя POP 7 и LIZ 1200 для мультиплекса 1,2 и 3 и LIZ 500 для мультиплекса 4. Анализ фрагментов проводили с использованием программного обеспечения Gene-mapper 4.1 (Applied Biosystems Inc Статистическую обработку проводили с использованием программного пакета Statistica 6.0 (Statsoft Inc.). Построение дендограммы проводили с использованием программного обеспечения BioNumerics 7.5 (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgium). Кластерный анализ был проведен методом невзвешенного попарного среднего (UPGMA). Для расчета дискриминирующей способности каждого локуса использовали индекс Хантера-Гастона (HGDI), расчет проводили с использованием интернет ресурса HPA (http://www.hpabioinformatics.org.uk/cgi-bin/DICI/DICI.pl) (Хантер и Гастон, 1988).
Результаты исследования и обсуждение
В результате проведенных исследований было проведено генотипирование 128 штаммов B. melitensis выделенных из 33 населенных пунктов трех областей Южного Казахстана (Жамбылская, Южно-Казахстанская, Алматинская области). Для нормализации и оценки достоверности полученных результатов использовался вакцинный штамм B. abortus RB51. Генотипирование было осуществлено с использованием MLVA-16, включающая панели 1, 2А и 2Б. Результаты генотипирования были депонированны в международной базе http://mlva.u-psud.fr/.
На основании панели 1 все 128 штаммов B. melitensis кластеризовались в три группы с известными генотипами 42 (n -108), 43 (n-2) и 63 (n-19) относящиеся к «Восточно-Средиземноморской» группе. Нами установлено, что на долю 42-го генотипа приходится 84,4% штаммов, данный генотип широко распространенного в Евразии и доминирует в Испании, Турции, Португалии и Китае (Al Dahouk S., Hai Jiang, Kiliç S). Только два штамма имели 43-й генотип, который широкий распространен в странах бассейна Средиземного моря (Al Dahouk S., Garofolo G., Kattar M., Aftab H., Kiliç S.). Генотип 63 является мало распространенным, по нашим подсчетам MLVAbank на декабрь 2014 года содержал 19 изолятов, из которых 12 приходится на Китай, единичные случаи выявления зарегистрированы в Турции, Испании и Франции (Hai Jiang, Al Dahouk S. Aftab H., Kiliç. S.), в нашем исследовании данный генотип имели 19 штаммов B. melitensis.
Использование 16 маркеров панели MLVA-16 позволил 128 штаммов бруцелл кластеризовать в 25 генотипов. Восемь генотипов были представлены только 1 штаммом. Самым большим являлся генотип GT9 который объединил в себя 38 (29,69%) штаммов, выделенных из 13 населенных пунктов. Два генотипа GT3 and GT5 включают по 17 (13,28%) щтаммов, которые выделены от животных из 11 и 7 населенных пунктов соответственно. Далее по убыванию GT20 и GT22 по 7(5,47%) штаммов, GT13, GT23 и GT1по 4 (3,13%) штаммов. Остальные генотипы представлены не более 3 штаммами (данные можно просмотреть в http://mlva.u- psud.fr). Поскольку отсутствуют последовательные эпизоотологические данные сложно выявить взаимосвязь вспышек. Тем не менее, повсеместная изоляция генотипов GT3, GT5, GT9, GT22, GT1, GT4, GT13, GT18 в очевидно несвязанных вспышках, указывает на циркуляцию штаммов с гомоплазией локусов MLVA-16 или историческое превалирование данных генотипов в Казахстане (Hai Jiang, Kattar M.M.).
Индекс вариабельности Хантера-Гастона (HGDI) с использованием 16 локусов MLVA-16 для 128 штаммов B. melitensis составил 0.871. Панель 2А в отношении B. melitensis не обладала дискриминационной способностью (HGDI=0). Панель 1 имела HGDI 0,287 с единственным полиморфмным аллелям Bruce 43 (HGDI=0.255). В панели 2В только четыре маркера были вариабельны Bruce 16, Bruce 30, Bruce 04 и Bruce 07 и обладали дискриминационной способностью 0,747, 0,451, 0,433 и 0.031 соответственно.
Заключение
Глобальное изучение генетического разнообразия бруцелл позволяет лучше понять пути распространения инфекции, вести мониторинг источников вспышек в неэндемичных регионах и обеспечить контроль за завозными случаями бруцеллеза. Несмотря на то, что Казахстан является эндемичным по бруцеллезу человека и животных, данные о генетическом разнообразии циркулирующих штаммов бруцелл весьма ограничены. Проведенные исследования по распределению генотипов B. melitensis, в последующем будет играть решающую роль для определения завозных случаев бруцеллеза животных и людей в неэндемичных регионах республики.
Список литературы
1. Сансызбаев А.Р. и др. Анализ ситуации по бруцеллезу животных в мире и Казахстане. Ветеринария. 2013.- №5. - С.52-60
2. Студенцов К.П. Бруцеллез животных: издательство Кайнар Алма-ата 1975. – 236С.
3. Aftab H., Dargis R., Christensen J.J., Le Fleche P., Kemp M.. Imported brucellosis in Denmark: molecular identification and multiple-locus variable number tandem repeat analysis (MLVA) genotyping of the bacteria. // Scand. J.Infect. Dis. 2011. - Vol. 43. - P. 536–538.
4. Al Dahouk S., Fleche P. L., Nockler K., Jacques I., et. all. Evaluation of Brucella MLVA typing for human brucellosis// Journal of Microbiological Methods. – 2007. Vol. 69. – P. 137-145.
5. Garofolo G., Ancora M., Di Giannatale E. MLVA-16 loci panel on Brucella spp. using multiplex PCR and multicolor capillary electrophoresis // J. Microbiol. Methods. - 2013. - Vol. 15. - P. 103 - 107.
6. Godfroid J.,et all Brucellosis at the animal/ecosystem/human interface at the beginning of the 21st century. // Prev Vet Med. -2011.- Nov 1;102(2). - P. 118-131.
7. Gwida M., Al Dahouk S., Melzer F., Rösler U., Neubauer H., Tomaso H. Brucellosis - regionally emerging zoonotic disease? // Croat Med J. - 2010. - Vol. 51(4). - P. 289-295.
8. Grushina T., Atshabar B, Syzdykov M, Daulbaeva S, et. all. Universal indirect enzyme-linked immunosorbent assay for monitoring of human and animal brucellosis in Kazakhstan. // Vaccine. 2010. - Vol. 1;28 Suppl 5. - P.:F46-48.
9. Kattar M.M., Jaafar R.F., Araj G.F., Le Fleche P., Matar G.M., Abi Rached, R., Khalife, S., Vergnaud, G. Evaluation of a multilocus variable-number tandemrepeat analysis scheme for typing human Brucella isolates in a region of brucellosis endemicity. // J. Clin. Microbiol. 2008. - Vol. 46. - P. 3935–3940.
10. Kiliç S, Ivanov IN, Durmaz R, Bayraktar MR, Ayaslioglu E, Uyanik MH, Aliskan H, Yasar E, Bayramoglu G, Arslantürk A, Vergnaud G, Kantardjiev TV.Multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis genotyping of human Brucella isolates from Turkey. J Clin Microbiol.
11. Mizanbayeva, S., Smits, H.L., Zhalilova, K., Abdoel, T.H., Kozakov, S., Ospanov, K.S., Elzer, P.H., Douglas, J.T. The evaluation of a user-friendly lateral flow assay for the serodiagnosis of human brucellosis in Kazakhstan. // Diagn. Microbiol. Infect. Dis.- 2009. - Vol. 65. - P. 14–20.
12. Pappas G., P. Papadimitriou N. Akritidis L. Christou, and E. V. Tsianos. The new global map of human brucellosis. Lancet Infection Disease. – 2006. – Vol. 6. – P. 91–99
13. Ravanela N., Gestin B., Maurina M. In vitro selection of fluoroquinolone resistance in Brucella melitensis //International Journal of Antimicrobial Agents. - 2009. - Vol. 34. - P. 76–81.
14. Hai Jiang, Heng Wang, Liqing Xu,Guiying Hu, Junying Ma, Pei Xiao,1 Weixing Fan, Dongdong Di, Guozhong Tian, Mengguang Fan, Jingchuan Mi, Ruiping Yu, Litao Song, Hongyan Zhao, Dongri Piao, and Buyun Cui. MLVA Genotyping of Brucella melitensis and Brucella abortus Isolates from Different Animal Species and Humans and Identification of Brucella suis Vaccine Strain S2 from Cattle in China // PLoS One. 2013; 8(10): e76332
15. Wilson K. Preparation of genomic DNA from bacteria // Current Protocols in Molecular Biology. - New York: Wiley. - 1987. - P. 650.
