Ключевые слова: АЧС, африканская чума свиней, ТФ ИФА, иммуноферментный анализ, антиген.

Keywords: ASF, African swine fever, ELISA, enzyme linked immunosorbent assay, antigen.

Введение. Африканская чума свиней (АЧС) – контагиозная септическая болезнь всех видов домашних свиней и диких кабанов. Болезнь проявляется остро, подостро, хронически и бессимптомно, и характеризуется лихорадкой, геморрагическим диатезом, воспалительными изменениями паренхиматозных органов [1,2].

В отсутствии эффективных вакцин обнаружение в пробах биоматериала антител или участка ДНК вируса АЧС позволяет с уверенностью  говорить  об  инфекционном процессе,  поэтому в  лабораторной диагностике заболевания используются как прямые методы, направленные на выявление генетического материала или антигенов вируса, так и косвенные методы обнаружения вирусспецифических антител.

Ежегодно справочная лаборатория по африканской чуме свиней (CISA-INIA, Мадрид, Испания)

Европейского Союза (ЕС) для проверки компетенции и уровня подготовки специалистов диагностических лабораторий ЕС и других заинтересованных стран организует проведение международных межлабораторных сличительных испытаний (МСИ) по диагностике АЧС. Принимающим участие организациям рассылаются зашифрованные панели образцов патматериала и сывороток крови.

Ключевым компонентом диагностических тест систем для выявления антител является используемый антиген. Чувствительность и специфичность диагностической тест-системы во многом зависит от его качества, поэтому в 2016 году в референтной лаборатория по АЧС ФГБУ «ВНИИЗЖ» на образцах сывороток панели МСИ проводили исследование пригодности разработанного комплексного антигена вируса АЧС для его использования в ТФ ИФА, а также сравнения полученных результатов с результатами анализов полученными при использовании коммерческих наборов.

Материалы и методы. Образцы: панель замороженных шифрованных сывороток крови в количестве 12 штук, полученная из справочной лаборатории по африканской чуме свиней ЕС. Подробное описание образцов указано в таблице 1.

ИФА: выявление антител к антигенам вируса АЧС проводили коммерческим набором ID Screen для непрямого ТФ ИФА (производитель IDVet, Франция) и с использованием метода ТФ ИФА на основе комплексного антигена (смесь очищенного вируса и рекомбинантного белка р30), разработанного в референтной лаборатории по АЧС ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Для подтверждения результатов методом иммуноблоттинга использовали коммерческие тест- полосы с перенесённым на них разделённым в полиакриламидном геле препаратом частично очищенного цельного вируса (производитель CISA-INIA) в соответствии с инструкцией производителя.

Таблица 1. 

Описание панели образцов

Шифр	Клин. форма	Вирулентность	Изолят	Геноти п	ДПЗ	Описание способа заражения
Сыворотки
С1	Острая	Вирулентный	L60 (Португалия)	I	5	в/м 105 ГАдЕ/мл
С2	Острая	Вирулентный	Ken06.Bus (Кения)	IX	12	в/м 105 ГАдЕ/мл
С3	Образец от интактной свиньи
С4	Острая	Вирулентный	NH/P68 (Португалия)-L60 (Португалия)- Arm07 (Армения)	I-II	9 после контроль- ного заражения	NH/P68 в/м 105ТЦД50/мл + в/м L60 10 ГАдЕ/мл + Arm07 10 ГАдЕ/мл. Сыворотка получена на 9 день после Arm07
С5	Хрони- ческая	Аттенуирован- ный	NH/P68 (Португалия)-L60 (Португалия)- Arm07 (Армения)	I-II	63 после контрольно го заражения	NH/P68 в/м 105ТЦД50/мл + в/м L60 10 ГАдЕ/мл + Arm07 10 ГАдЕ/мл. Сыворотка получена на 63 день после Arm07
С6	Образец от интактной свиньи
С7	Образец от интактной свиньи
С8	Острая	Вирулентный	LT14/1492 (Литва)	II	21	От свиньи, содержащейся в контакте со свиньями которым в/м инъецировали LT14/1492 в дозе 10 ГАдЕ/мл
С9	Острая	Вирулентный	Arm07 (Армения)	II	7	Arm07 10 ГАдЕ/мл
С10	Хрони- ческая	Аттенуирован- ный	NH/P68 (Португалия)- Arm07 (Армения)	I-II	126	NH/P68 в/м 102 ТЦД50/мл + Arm07 10 ГАдЕ/мл.
С11	Хрони- ческая	Аттенуирован- ный	NH/P68 (Португалия)- Arm07 (Армения)	I-II	65	NH/P68 в/м 102 ТЦД50/мл + Arm07 10 ГАдЕ/мл.
С12	Образец от интактной свиньи

С – сыворотка;

ДПЗ – день после заражения;

ТЦД – тканевая цитопатогенная доза; ГАдЕ – гемадсорбирующая единица

Результаты и обсуждение. Все серологические методы, которыми исследовали панель образцов, как в справочной лаборатории ЕС, так и в референтной лаборатории по АЧС ФГБУ «ВНИИЗЖ» показали одинаковые результаты для 11 из 12 сывороток (таблица 2). Из них антитела к антигенам вируса АЧС выявлялись в сыворотках номер 4, 5, 10 и 11. Анализ результатов показал, что современные коммерческие наборы в данных условиях имели сравнимую чувствительность и специфичность. Однако коммерческие наборы на основе ТФ ИФА продемонстрировали меньшую чувствительность в сравнении с иммуноцитохимическим методом.

Таблица 2. Серологические исследования

 

С1

С2

С3

С4

С5

С6

С7

С8

С9

С10

С11

С12

ЕС

МЭБ-ИФА

-

-

-

+

+

-

-

-

л. о.

+

+

-

Ingenasa K3

-

-

-

+

+

-

-

-

л. о.

+

+

-

IDVet

-

-

-

+

+

-

-

-

сомн

+

+

-

АЧС

IDVet

-

-

-

+

+

-

-

-

сомн

+

+

-

РЛАЧС-ИФА

-

-

-

+

+

-

-

-

+

+

+

-

Подтверждающие тесты

ЕС

ИБ

-

-

-

+

+

-

-

-

л. о.

+

+

-

ИЦХ

-

-

-

+

+

-

-

-

+

+

+

-

АЧС

ИБ

-

-

-

+

+

-

-

-

+

+

+

-

Заключение

Заключение ЕС

-

-

-

+

+

-

-

-

сл. пол

+

+

-

Заключение АЧС

-

-

-

+

+

-

-

-

+

+

+

-

С – сыворотка

«-» – отрицательно

«+» - положительно

л.о. - ложноотрицательно

сл. пол – слабоположительно сомн. – сомнительный результат

АЧС – референтная лаборатория по АЧС ФГБУ «ВНИИЗЖ»

ЕС - справочная лаборатория по АЧС Европейского Союза РЛАЧС-ИФА – тест система реф. лаб. по АЧС

МЭБ-ИФА – непрямой ТФ ИФА, описанный в Руководстве по диагностике АЧС (раздел 2.8.1., 2012 год) Ingenasa K3 – коммерческий блокирующий ТФ ИФА Ingezim PPA Compac (11.PPA k3), основанный на P72 IDVet – коммерческий ТФ ИФА набор ID Screen, основанный на рекомбинантных P32, P62 и P72

ИБ – иммуноблоттинг, описанный в Руководстве по диагностике АЧС (раздел 2.8.1., 2012 год)

ИЦХ – непрямой иммуноцитохимический метод на основе инфицированных изолятом E70М, согласно протоколу справочной лаборатории по АЧС Европейского Союза

Различия наблюдались только для образца №9, который справочная лаборатория обозначили как слабоположительный. Данный образец отобран на 7 день после заражения, что, сообразно механизму выработки иммунного ответа, является сроком часто недостаточным для успешного образования высокоспецифичных антител в выявляемых количествах. Тест-системы, использующие в качестве компонентов антигена белки, накапливаемые в больших количествах на ранние сроки после интернализации вируса, имеют преимущества при исследовании таких образцов. Например, белок р30 (также называемый p32 или продуктом экспрессии гена CP204L), ответственный за интернализацию вируса в клетку и индуцирующий развитие гуморального и клеточного иммунного ответа в in vitro инфицированных клетках, выявляется на более ранних сроках, чем некоторые другие вирусные белки [5]. Это позволяет тест- системам, направленным на выявление антител к этому белку, иметь более высокую чувствительность на ранних стадиях инфекции, по сравнению с методами, направленными на выявление антител к антигенам очищенного вируса или белкам, продуцируемым на более поздних стадиях инфекции [5]. Так, справочная лаборатория ЕС при исследовании сыворотки №9 получила ложноотрицательные результаты при применении набора Ingezim PPA Compac, использующем в качестве антигена рекомбинантный белок p72, и в методе ТФ ИФА, описанном МЭБ, в котором используется препарат частично очищенного вируса.

В референтной лаборатории по АЧС ФГБУ «ВНИИЗЖ» для исследования панели образцов использовали коммерческий набор IDVet и получили результаты, аналогичные результатам, полученным в справочной лаборатории европейского союза при использовании того же диагностического набора (таблица 3). Сыворотки также были исследованы в экспериментальной тест-системе референтной лаборатории ФГБУ «ВНИИЗЖ» по АЧС для определения чувствительности и специфичности используемого комплексного антигена (таблица 3). В исследованиях положительными считали сыворотки с оптической плотностью субстратного раствора в лунке в 2,1 и более раза выше оптической плотности отрицательного контроля. Полученные результаты согласуются с результатами справочной лаборатории ЕС. Это указывает на то, что полученный антиген, при использовании его в качестве компонента тест-системы, позволяет получить высокую чувствительность и специфичность.

Таблица 3. Оптическая плотность субстрата в экспериментальной тест-системе референтной лаборатории по АЧС

	К-	С1	С2	С3	С4	С5	С6	С7	С8	С9	С10	С11	С12
ОП 450	0,09	0,09	0,07	0,07	0,86	0,91	0,05	0,04	0,08	0,36	0,52	0,37	0,06
	0,16	0,08	0,08	0,06	0,83	0,81	0,05	0,05	0,09	0,22	0,71	0,34	0,06
ЕС		-	-	-	+	+	-	-	-	сл. пол	+	+	-
АЧС		-	-	-	+	+	-	-	-	+	+	+	-

С – сыворотка

«-» – отрицательно

«+» - положительно

сл. пол – слабоположительно

«К-» - отрицательный контроль

«К+» - положительный контроль

ОП450 – оптическая плотность субстрата при длине волны 450 нм

ЕС – заключение справочной лаборатории по АЧС Европейского Союза АЧС – заключение референтной лаборатория по АЧС ФГБУ «ВНИИЗЖ»

 Результаты иммуноблотинга. На блотограмме (рис. 1) панели образцов видно, что сыворотки под номерами 4, 5, 10 и 11 реагируют более чем с одним белком и имеют специфический паттерн окраски продукта реакции исследуемых сывороток с вирусными белками, схожий с паттерном окраски контрольной положительной сыворотки (не представлена). Остальные образцы имеют единичные окрашенные полосы неспецифического взаимодействия аналогичные тем, которые наблюдались для отрицательного контроля в данной реакции (не представлен на рисунке). Образец номер 9 помимо этого имеет дополнительную окрашенную полосу, что,  согласно стандартной операционной процедуре  справочной лаборатории ЕС, может являться визуализацией антител против ранних белков вируса АЧС, например, р12 или р30 [4].

Заключение. Комплексный антиген, полученный в референтной лаборатории по АЧС ФГБУ «ВНИИЗЖ», пригоден для использования при разработке тест-систем для выявления антител к вирусу АЧС в ТФ ИФА. Метод ТФ ИФА с использованием данного антигена показал на панели референтных образцов чувствительность и специфичность, сравнимую с коммерческими тест-системами. Метод ТФ ИФА с использованием комплексного антигена при исследовании данных референтных образцов позволяет выявлять антитела к антигенам вируса АЧС, начиная с 7 дня после инфицирования.

 

Список литературы

 

1.                   Ремыга, С.Г. Клинические и патологоанатомические изменения у диких европейских кабанов и домашних свиней при заражении вирусом африканской чумы свиней / С.Г. Ремыга, А.С. Першин, И.В. Шевченко [и др.] // Ветеринария Сегодня. – 2016. – № 3 (18). – c. 46–51.

2.                   Шевченко, И.А. Клинико-анатомическое проявление африканской чумы свиней при заражении разными методами вирусом, выделенным от дикого кабана / И. В. Шевченко, С. Г. Ремыга, А.С. Першин [и др.] // Современные проблемы пат. анатомии, патогенеза и диагностики болезней животных: материалы 18-й Междунар. научно-методич. конф. - М., 2014. - С.82-84.

3.                   Afonso, C.L. Characterization of P30, a highly antigenic membrane and secreted protein of   African Swine Fever Virus / C. L. Afonso, C. Alcaraz, A. Brun [et al] // Virology. – 1992. - Vol. 189. – p. 368–373.

4.                   Standard operating procedure for the detection of antibodies against african swine fever by immunoblotting // Centro de investigation en sanidad animal (CISA-INIA) European Union Reference Laboratory for ASF, (EURL-ASF). - rev. 2013 - p. 1-7.

5.                   Pérez-Filgueira, D.M. Optimization and validation of recombinant serological tests for African Swine Fever diagnosis based on detection of the p30 protein produced in Trichoplusia ni larvae / D.M. Pérez-Filgueira, F. González-Camacho, C. Gallardo [et al] //J Clin Microbiol. – 2006. – vol. 44. – P. 3114- 3121.