СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДОВ ФАРМАКОПЕЙНОГО АНАЛИЗА ЦЕФАЛОСПОРИНОВ ПО ДАННЫМ РАЗЛИЧНЫХ ФАРМАКОПЕЙ

В статье приведен краткий обзор методов фармакопейного анализа цефалоспоринов по данным различных национальных фармакопей. В современном мире гармонизация требований к стандартизации и контролю качества ЛС является одним из необходимых условий создания качественных, эффективных и безопасных ЛС.

Ключевые слова: цефалоспорины, сравнение методов фармакопейного анализа, национальные фармакопеи.

Процессы глобализации и взаимного сотрудничества различных стран мира в настоящее время привели к необходимости гармонизации требований, предъявляемых к качеству лекарственных средств (ЛС). Гармонизация необходима для лучшего понимания всеми заинтересованными сторонами особенностей разработки, одобрения и утверждения фармакопейных статей [1].

Трудности на этом пути обусловлены рядом причин, в том числе:

·                     недостаточным охватом лекарственных средств статьями национальной фармакопеи;

·                     отсутствием опыта гармонизации национальных фармакопейных требований;

·                     существенным различием в степени гармонизации фармакопейных требований с ведущими фармакопеями мира.

В этой связи представляется интересным провести сравнение методов фармакопейного анализа лекарственных средств, включенных в различные национальные фармакопеи, на примере β – лактамных антибиотиков – цефалоспоринов. Широкое клиническое применение цефалоспоринов началось в конце 70-х годов. К настоящему времени получено более 50 цефалоспоринов, которые по ряду параметров превосходят антибиотики других классов.

Препараты цефалоспоринов наиболее широко представлены в Фармакопее США и в японской Фармакопее [2,3]. В Фармакопее Республики Беларусь представлено 6 препаратов этого класса антибиотиков [4]. В ГФ РФ ХI, ХII изданий препараты цефалоспоринов не представлены. Первый препарат группы цефалоспоринов был зарегистрирован в России в 2009 г.

Цефалоспорины (цефемы) - антибиотики, являющиеся производными 7-аминоцефалоспорановой или 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (1):

Кроме цефемов к цефалоспоринам относятся цефамицины (7-метоксицефалоспорины), оксацефемы и карбацефемы (2):

Цефалоспорины в зависимости от химической структуры подразделяют на следующие группы:

·                     цефалоспорины – кислоты (цефазолин, цефалотин) (3):

·                     аминоцефалоспорины (цефалексин) (4):

·                     аминоцефалоспорины, замещенные у атома азота (цефоперазон) (5):

 цефалоспорины, содержащие иминогруппу (цефтриаксон, цефотаксим, цефтазидим, цефуроксим, и др.) (6):

Для установления подлинности цефалоспоринов используют спектроскопические методы.

УФ-спектры. Наличие хромофора, включающего двойную связь C=C и амидную группу, обусловливает способность цефалоспоринов поглощать электромагнитное излучение в ближней УФ- области (максимум поглощения 260 – 270 нм) [5].

Для идентификации цефалотина натриевой соли в работе Лебедевой Н.Н. [5] использовалось наличие в УФ-спектре водного раствора препарата максимума поглощения при λ=237 нм. Присутствие «плеча» при λ=265 нм отнесено к циклической системе 7-аминоцефалоспорановой кислоты. При длине волны 237 нм раствор цефалотина натриевой соли 0,002% в кювете длиной 10 мм имеет оптическую плотность 0,65 - 0,72 (раствор сравнения вода [5].

ИК-спектры.

ИК-спектры цефалоспориновых антибиотиков были детально изучены в работе [5]. В соответствии с полученными данными заключение о подлинности цефалоспориновых антибиотиков позволяют сделать ИК-спектры в области 4000-400 см-1. С их помощью, по данным автора, можно установить наличие или отсутствие ацетоксигруппы в боковой цепи по С3 дигидротиазинового цикла и подтвердить отнесение испытуемого препарата к числу производных 7-АДЦК (цефалексин, цефалоридин, цефазолин, цефтриаксон) или 7-АЦК (цефалотин, цефапирин, цефатаксим, цефуроксим). Как показано в работе [5], для всех цефалоспоринов общими являются полосы в области колебаний карбонильных групп (1800-1500 см-1) и карбоксильной группы (1620-1600 см-1). В другой области более высоких частот (3500-2500см-1), обусловленных валентными колебаниями амино- и амидогрупп, ИК-спектры имеют существенные различия. Наиболее специфические полосы расположены в области «отпечатков пальцев» (1500-650 см-1) (Рис.1)

Оптическая активность. В соответствии с данными Ph.Eur.4 [6] цефалоспорины являются оптически активными веществами и могут быть как правовращающими, так и левовращающими (табл. 1). Так, натриевые соли цефалотина, цефотаксима, цефуроксима, а также цефалексин вращают плоскость поляризации плоскополяризованного света вправо, в то время как натриевые соли цефазолина и цефтриаксона – влево [6].

Таблица 1 − Удельное вращение цефалоспоринов (согласно Ph.Eur.4) [6].

Химические свойства цефалоспоринов. Наличие карбоксильной группы обусловливает кислотные свойства цефалоспоринов. На кислотно-основные свойства цефалоспоринов влияют радикалы, находящиеся в 3-ем (R2) и 7-ом (R1) положениях цефемного ядра (7) [7]. Например, в ацильном остатке R1 у цефалексина содержится аминогруппа, поэтому в целом цефалексин проявляет амфотерные свойства. У цефтазидима преобладают кислотные свойства (карбоксильная группа, связанная с цефемным ядром, образует внутреннюю соль с пиридиниевым ионом, находящимся в радикале R2). Цефтриаксон является динатриевой солью (кислотными свойствами обладает гетероциклический остаток R2).

Цефалоспорины могут вступать в реакции гидролиза с образованием гидроксамовых кислот. Продукты гидролиза цефалоспоринов в кислой и щелочной средах подвергаются различным превращениям (изомеризации,   декарбоксилированию).

Цефалоспорины проявляют восстановительные свойства благодаря наличию дигидротиазинового фрагмента. Окисление цефалоспоринов приводит к образованию окрашенных продуктов, что позволяет использовать окислительно-восстановительные реакции для идентификации препаратов цефалоспоринов. Например, при действии 1% раствора азотной кислоты в 80%-ной серной кислоте на цефалексин появляется жёлтое окрашивание, на цефалотина натриевую соль – оливково-зелёное, переходящее в красновато- коричневое и т.д.

Цефалоспорины (подобно пенициллинам) образуют окрашенные продукты при взаимодействии с реактивом Марки [7].

Идентификация цефалоспоринов.

В соответствии с данными различных национальных Фармакопей для идентификации цефалоспоринов используют методы ИК-, УФ-, ЯМР-спектроскопии, ВЭЖХ, ТСХ, химические методы (реакция на катион натрия, проба с реактивом Марки).

В частности, для испытания на подлинность цефазолина натриевой соли Белорусская, Европейская, Британская Фармакопеи рекомендуют метод ИК – спектроскопии [4,6,8]. Японская Фармакопея дополнительно рекомендует спектроскопию в УФ и видимой области и ЯМР- спектроскопию [3]. Фармакопея США рекомендует УФ – спектроскопию и ВЭЖХ [2]. Все рассмотренные Фармакопеи предлагают реакцию на натрий.

Испытания на чистоту.

В соответствии с данными различных Фармакопей [4, 6, 8] для цефалоспоринов определяются такие показатели, как удельное вращение, цветность, прозрачность и рН растворов, примеси родственных соединений и остаточных растворителей (N,N- диметил-анилин, 2-этилгексановая кислота), бактериальные эндотоксины, тяжелые металлы, сульфатная зола [6,7]. Растворы большинства цефалоспоринов имеют нейтральную или слабокислую среду (наименьшее допустимое значение рН у цефтазидима натриевой соли, в структуре которого имеется дополнительная карбоксильная группа; наибольшее – у цефуроксима натриевой соли).

Количественное определение цефалоспоринов.

Фармакопея США, Белорусская, Европейская и Британская Фармакопеи рекомендуют для количественного определения цефалоспоринов как в субстанции, так и в готовых лекарственных средствах метод ВЭЖХ [2,4,6,8].

В качестве неподвижной фазы при этом рекомендуется октадецилсиликагель (большинство цефалоспоринов), а также гексилсиликагель (цефуроксим, цефиазидим) и триметилсилилсиликагель (цефуроксимаксетил). Подвижные фазы представляют собой смеси ацетонитрила или (и) метанола и водных буферных растворов (фосфатный, ацетатный, цитратный). Детекция - спектрофотометрическая.

Для количественного определения цефалоспоринов используются также УФ-спектрофотометрия и кислотно-основное титрование в неводных средах.

При сравнении данных различных Фармакопей обнаруживается различие в составе подвижной фазы.

Подвижная фаза по Британской Фармакопее – смесь раствора фосфатного буфера с pH 5.0 и метанола [8].

Белорусская и Европейская Фармакопеи предлагают смесь состава метанол : ацетонитрил : раствор калия дигидрофосфата : вода (2:5:10:83) [4,6].

В Фармакопее США предлагается в качестве подвижной фазы смесь воды, ацетонитрила, метанола и триэтиламина (850:100:50:15)[2].

Для количественного определения цефалоспоринов используются также УФ-спектрофотометрия и кислотно-основное титрование в неводных средах [4,6].

Контроль качества антибиотиков предполагает обязательный показатель ˗ «Специфическая активность», который включает в себя биологические и микробиологические методы. Последние характеризуются более высокой степенью вариабельности, чем физико - химические.

ГФ XIII включает ОФС 1.2.4.0010.15 «Определение антимикробной активности антибиотиков методом диффузии в агар», которая вводится вместо ОФС 42-0068-07 ГФ XII [9].

Данная ОФС включает валидированные методы количественного определения антибиотиков, основанные на их способности угнетать рост микроорганизмов. Активность исследуемого антибиотика оценивают путём сравнения угнетения роста чувствительных микроорганизмов, вызванного известными концентрациями исследуемого антибиотика и государственного стандартного образца данного антибиотика. Определение проводят на твёрдых средах.

При определении антимикробной активности используют стандартные образцы, которые устанавливают в соответствии с международными биологическими стандартами.

Используемые тест-микроорганизмы, условия проведения испытания, стандартные растворы для различных антибиотиков различны и устанавливаются индивидуально.

Так, для цефалексина ГФ XIII приводит следующие требования:

·                     тест-микроорганизм: АТСС 6633;

·                     среда: нижний слой № 11, верхний слой №7+0,1% глюкозы;

·                     количество среды: 10мл (нижний слой) и 5мл (верхний слой);

·                     стандартный образец: Цефалексин;

·                     растворитель: буфер №1;

·                     контрольная концентрация раствора стандартного образца: 5 мкг/мл.

В таблице «тест микроорганизмы и условия для биологического определения активности антибиотиков» ОФС 1.2.4.0010.15 представлен также препарат цефалотина натриевая соль [9].

Международная Фармакопея, как и ГФ РФ, предлагает проводить определение активности антибиотиков методом диффузии в агар. Статья МФ т.1 стр. 165 [10]       «Количественное определение микробиологической активности антибиотиков» идентична ФС ГФ РФ [9].

Фармакопея США в статье 81 «Antibiotics – microbial assays» USP29 [2] предлагает для определения активности антибиотиков наряду с методом диффузии в агар турбидиметрический метод. Последний основан на измерении степени помутнения жидкой среды, происходящей в процессе роста микроорганизмов.

Фармакопея Республики Беларусь аналогично с Фармакопеей США описывает две методики определения: диффузии в агар и турбидиметрии (т.1, ст.2.7) [4].

В заключение следует подчеркнуть, что в современном мире, характеризующемся все большей тенденцией к интеграции, гармонизация требований к стандартизации и контролю качества ЛС является одним из необходимых условий создания качественных, эффективных и безопасных ЛС. Сравнительный анализ методов ФА цефалоспоринов, представленных в различных национальных и международных Фармакопеях, выявляет необходимость решения следующих задач:

·          разработка унифицированных методик анализа лекарственных форм цефалоспоринов методами УФ- и ИК-спектроскопии [5];

·          разработка экспресс - методик установления подлинности лекарственных форм       β – лактамидов методом ТСХ с использованием оборудования отечественного производства;

·          включение разработанных методик в ГФ;

·          составление атласа УФ и ИК - спектров цефалоспоринов.

Список литературы и источников

1.        Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии № 119 «О концепция гармонизации фармакопей государств – членов евразийского экономического союза» от 22.09.15

2.        Фармакопея США : USP 29 ; Национальный формуляр : NF 24 : в 2 т.: [пер. с англ.]. – М.: ГЭОТАР- Медиа, 2009.

3.        JP 16, Pharmaceuticals and Medical Devices Agency, Shin-Kasumigaseki Building, 3-3-2 Kasu-migaseki, Chiyoda-ku, Tokyo 100-0013 Japan.

4.        Государственная Фармакопея Республики Беларусь. В 3 т. Т. 3. Контроль качества фармацевтических субстанций / УП «Центр экспертиз и испытаний в здравоохранении»; под общ. ред. А. А. Шерякова. – Минск: Минский государственный ПТК полиграфии им. В. Хоружей, 2009 .

5.        «Разработка комплексного подхода к обнаружению фальсифицированных лекарственных средств группы цефалоспоринов»: Лебедева Н.Н. Автореферат. - Москва, 2011, 25 стр.

6.        European Pharmacopoeia 8.0: Vol-2. Author, Council of Europe. Edition, 5. Publisher, Council of Europe, 2014. Length, 2133 pages.

7.        http://medbooks.org/index.files/book/Farmacevticheskij_marketing/013286/Antibiotiki.pdf

8.        British Pharmacopoeia Volume III, Formulated Preparations: Specific Monographs

9.        Государственная Фармакопея РФ XIII издание, том 3, М.: ФЭМБ, 2015. ˗ 1294 с.

10.     Международная Фармакопея. Третье издание. В 3 томах. Всемирная организация здравоохранения, Женева, 1981, ил.