ОПРЕДЕЛЕНИЕ 2-МЕТОКСИ-4-ФОРМИЛГИДРОКСИБЕНЗОЛА В ПЛАЗМЕ МЕТОДОМ СПЕКТРОФОТОМЕТРИИ

2-метокси-4-формилгидроксибензол (синонимы: ванилин, 4-гидрокси-3-метоксибензальдегид, 4- гидрокси-3-анисбензальдегид) (далее по тексту 2-МО-4-ФГОБ) – это биологически активное соединение, которое используется в пищевой промышленности, косметологии, а также в качестве аналитического реагента и полупродукта органических синтезов [2, 9]. Имеются указания на возможность использования этого вещества для лечения псориаза [6].

Молярная масса 2-МО-4-ФГОБ 152,15, брутто-формула С8Н8О3.

По физическим свойствам это белый кристаллический порошок с приятным ароматическим ванильным запахом. Температура плавления 2-МО-4-ФГОБ = 81-83оС, рКа = 7,4, log Kow = 1,37. Растворимость 2-МО-4-ФГОБ в воде составляет 11,02 г/л (по другим данным более 2% или 1:125), в глицерине – 1:20, в этаноле – 1::2. Вещество растворимо в хлороформе, ацетоне, бензоле и диэтиловом эфире [7].

Рассматриваемое вещество обладает токсическими свойствами для теплокровных. LD50 2-МО-4- ФГОБ (в мг/кг) для крыс при пероральном введении составляет 1580, при внутрибрюшинном – 1160, при подкожном – 1500, при перкутанном в – более 5010 мг/кг [7, 8].

Известны случаи отравления людей 2-МО-4-ФГОБ различной степени тяжести [8].

Широкое применение 2-МО-4-ФГОБ, его токсические свойства и оаисанные случаи отравления данным веществом людей позволяют рассматривать его в качестве потенциального объекта химико- токсикологического анализа.

Целый ряд вопросов химико-токсикологического анализа данного соединения относительно мало изучены. К ним, например, относятся вопросы оценки количественного содержания аналита в жидких биоматрицах.

Цель данной работы – изучение особенностей определения 2-МО-4-ФГОБ в плазме крови методом спектрофотометрии.

Материалы и методы исследования

Объектом проведённого исследования явился 2-метокси-4-формилгидроксибензол (2-МО-4-ФГОБ) (фирмa Acros, содержание основного вещества 99 %).

В качестве вероятного метода анализа изучена электронная спектрофотометрия. Как среда для растворения аналита рассмотрен 95% этанол [1, 3].

Спектрофотометрию этанольных растворов 2-МО-4-ФГОБ осуществляли, используя прибор СФ- 2000 и кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 см. Характер поглощения этанольного раствора анализируемого вещества изучали в области «кварцевого» ультрафиолета. Оценку количественного содержания аналита а дальнейшем проводили, проводя измерения оптической плотности в области длинноволнового максимума.

Находили концентрационную область подчинения объединённому закону Бугера-Ламберта-Бера. Для линейного диапазона концентраций аналита рассчитывали уравнение регрессии.

Выполняли шесть параллельных определений 2-МО-4-ФГОБ в субстанции и проводили статистическую обработку результатов.

Исходя из результатов, полученных на предварительной стадии исследований, осуществляли разработку методики спектрофотометрического определения 2-МО-4-ФГОБ в плазме. Для этого в плазму (постоянная масса 25 г) вводили исследуемое вещество в количествах 2,5-50,0 мг), получая, таким образом, серию модельных смесей [4, 5].

Результаты исследования и их обсуждение

Выявленные особенности УФ-спектра 2-МО-4-ФГОБ в среде 95 % этанола состоят в том, что спектр содержит четыре достаточно интенсивных полосы поглощения с максимумами при 207, 232, 280 и 310 нм.

При количественных определениях исследуемого вещества по собственному поглощению в среде 95% этанола, связанных с измерениями оптической плотности в области длинноволнового максимума (310 нм), отмечено наличие линейной зависимости интенсивности сигнала (А, ед. о. п.) от содержания (С, мкг/мл) 2- МО-4-ФГОБ в фотометрируемом растворе в интервале 0,5-12,0 мкг/мл.

На основе выявленной зависимости рассчитано уравнение регрессии, которое выглядит следующим образом: А=0,089245∙С-0,000425.

Была выполнена серия из шести параллельных определений аналита в субстанции с использованием разработанной схемы. По этой схеме точную навеску (около 0,025 г) исследуемого вещества вносили в мерную колбу внутренним объёмом 50 мл, растворяя в 95% этаноле, и доводили этим же растворителем до метки (раствор А). 1,0 мл раствора А помещали в мерную колбу внутренним объёмом 25 мл и доводили до метки 95% этанолом (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б измеряли при 310 нм. Результаты серии определений аналита в субстанции (n=6; Р=0,95) отражены в табл. 1.

Таблица 1 Результаты количественного определения 2-метокси-4-формилгидроксибензол (2-МО-4-ФГОБ) в субстанции методом спектрофотометрии (n=6, P=0,95)

Как можно видеть в табл. 1, относительная ошибка среднего результата (n=6, P=0,95) равняется

 Выявлена целесообразность использования спектрофотометрии в УФ-части спектра по характеру поглощения в среде 95% этанола для определения исследуемого вещества в плазме.

В соответствии с предлагаемой методикой порцию биожидкости массой 25 г, содержащую заданное количество 2-МО-4-ФГОБ, настаивали дважды по полчаса с ацетоном (порции по 50 г каждая). Полученные извлечения отделяли от фрагментов биоматрицы посредством фильтрования через бумажный фильтр, после чего фильтр промывали 20 г ацетона.

Извлечения и промывную жидкость объединяли, растворитель испаряли при 18-22оС в токе воздуха.

Остаток подвергали растворению в 5 мл ацетона 0,05 мл ацетонового раствора наносили на линию старта стандартной пластины «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ и хроматографировали, применяя в качестве подвижной фазы смесь гексан-ацетон (7:3). Проявление хроматограмм проводили, облучая их УФ- светом (254 нм). Аналитэлюировалиизсорбента10млэтанолавтечение10мин. Оптическую плотность элюата измеряли при длине волны 310 нм.

Результаты определения 2-МО-4-ФГОБ в модельных смесях с плазмой (по 5 параллельных определений каждой концентрации вещества в биожидкости) приведены в табл. 2.

Таблица 2 Результаты количественного определения 2-метокси-4-формилгидроксибензола (2-МО-4-ФГОБ) в плазме предлагаемой методикой (n=5, P=0,95)

Как видно из данных табл. 2, при содержании 2,5-50,0 мг аналита в 25 г биологического объекта разработанная методика позволяет определить в плазме крови 64,93-66,22% 2-МО-4-ФГОБ с полушириной доверительного интервала 1,88-3,10%. Предел количественного определения исследуемого вещества в 100 г плазмы составляет 0,02 мг.

Выводы

1.   Исследован характер поглощения УФ-света 2-метокси-4-формилгидроксибензолом в среде 95% этанола.

2.    Обоснована целесообразность использования УФ-спектрофотометрии по поглощению в среде 95% этанола для количественного определения рассматриваемого соединения.

3.      Предложена методика определения 2-метокси-4-формилгидроксибензола в плазме крови. Полуширина доверительного интервала (n=5; P=0,95) составляет 1,88-3,10%.

Список литературы

1.    Асташкина А.П., Шорманов В.К., Останин М.А., Гришечко О.И., Елизарова М.К. Распределение метоксипроизводных гидроксибензола в организме теплокровных животных // Фармация. – 2013. – Т. 62, № 5. – С. 5-8.

2. Мартыненко Э.Я. Технология коньяка. – Симферополь: Таврида, 2003. – 320 с

3.   Пугачёва О.И., Асташкина А.П., Шорманов В.К., Останин М.А. Особенности распределения 2,4- и 2,6-диметильных производных гидроксибензола в организме теплокровных животных // Судебно- медицинская экспертиза. – 2014. – Т. 57, № 4. – С. 44-48.

4. Шорманов В.К., Коваленко Е.А., Дурицын Е.П. Определение фурадана в биологических жидкостях // Судебно-медицинская экспертиза. – 2005. – Т. 48, № 5. – С. 36-39.

5.    Шорманов В.К., Коваленко Е.А., Дурицын Е.П., Маслов С.В., Галушкин С.Г., Прониченко Е.И. Определение карбофурана при судебно-химическом исследовании биологического материала // Судебно-медицинская экспертиза. – 2013. – Т. 56, № 4. – С. 30-34.

6.   Cheng H.-M., Chen F.-Y., Li C.-C., Lo H.-Y., Liao Y.-F., Ho T.-Y., Hsiang C.-Y. Oral Administration of Vanillin Improves Imiquimod-Induced Psoriatic Skin Inflammation in Mice // J. Agric. Food Chem. – 2017. – Vol. 65, N 47. – Р. 10233-10242.

7. Vanillin. CASRN: 121-33-5. 1.    Available at: https://toxnet.nlm.nih.gov/cgi-bin/sis/search/a?dbs+hsdb:@term+@DOCNO+1027. Accessed May15, 2020.

8. Vanillin. ScienceLab.com. Available at: file:///D:/ГИДРОКСИБЕНЗОЛЫ/Ванилин/Свойства%20и%20токсичность%20(ЛД%2050)%20msds.pdf         . Accessed May15, 2020.

9.   Zamzuri N.A., Abd-Aziz S. Biovanillin from agro wastes as an alternative food flavour // J. Sci. Food Agric. – 2013. – Vol. 93, N 3. – Р. 429-438.