ИЗУЧЕНИЕ ДИНАМИКИ РАЗЛОЖЕНИЯ 2,6-ДИ-ТРЕТ-БУТИЛ-4-МЕТИЛГИДРОКСИБЕНЗОЛА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

2,6-Ди-трет-бутил-4-метилгидроксибензол (в дальнейшем - 2,6-ДТБ-4-МГОБ) – биологически активное соединение антиоксидантного и цитостатического действия [6, 7, 8]. Оно используется в медицинской и ветеринарной практиках, является присадкой в технических маслах, применяется в пищевой промышленности [2, 8].

2,6-ДТБ-4-МГОБ – белые кристаллы с температурой плавления 68,5-70оС и слабым запахом. Его растворимость в воде – 0,6 мг/л при 25ºC. Вещество растворяется в предельных и ароматических углеводородах, низших алканолах, ацетоне, метилэтилкетоне, петролейном эфире [1].

2,6-ДТБ-4-МГОБ токсичен для теплокровных. При применении per os LD50 данного вещества для самцов крыс-альбиносов породы Wistar составляет 1700-1970 или 890 мг/кг, LD100 для кошек – 940-2100 мг/кг [6].

Токсичность 2,6-ДТБ-4-МГОБ, его активное применение в медицине, пищевой отрасли, технике позволяют считать его потенциальным объектом химико-токсикологического анализа. В химико- токсикологическом отношении 2,6-ДТБ-4-МГОБ до настоящего времени изучен недостаточно.

Целью исследования являлось изучение динамики разложения 2,6-ДТБ-4-МГОБ в биологическом материале.

Материалы и методы исследования

Объект исследования –   2,6-ди-трет-бутил-4-метилгидроксибензол (2,6-ДТБ-4-МГОБ) фирмы «Acros organics» (содержание вещества 99,8%).

Серия экспериментов in vitro проводилась на модельных смесях 2,6-ДТБ-4-МГОБ с измельчённой тканью печени (содержание аналита в смесях – 0,1 г в 100 г биоматрицы) [3-5].

Модельные смеси сохраняли при температурах 0оС, 8-10оС, 20-22оС в герметично закрытых пластмассовых стаканах на 100 см3. Также сохраняли и контрольные образцы печени. Исследования модельных смесей и контрольных образцов проводили через полтора часа после начала эксперимента и далее – через определенные промежутки времени.

Изолирование. 25 г модельной смеси или такое же количество контрольного образца дважды 30 минут настаивали с 50 мл смеси этилацетат-ацетон (7:3 по объёму) при периодическом перемешивании. Извлечения отделяли от частиц биоматрицы, объединяли в выпарительной чашке, растворитель испаряли в токе воздуха до сухого остатка.

Очистка извлечений. Остаток растворяли в 2-2,5 мл смеси гексан-ацетон (9,5:0,5). Раствор вносили в колонку (490×11 мм), заполненную 10 г силикагеля L 40/100 мкм. После вхождения раствора в сорбент элюировали смесью гексан-ацетон (9,5:0,5). Элюат собирали фракциями по 2 мл. Аналит обнаруживали во фракциях методом ТСХ (пластины «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ, подвижная фаза хлороформ-бензол (9:1), режим детектирования – облучение УФ-светом) по наличию пятен на хроматограммах, величина Rf которых соответствовала таковой стандарта (0,75±0,04). Фракции элюата, содержащие 2,6-ДТБ-4-МГОБ (в стандартных условиях с 5 по 8 фракцию (9-16 мл)), объединяли и упаривали в токе воздуха при комнатной температуре до получения сухого остатка. Остаток растворяли в 5 мл ацетона. В две выпарительные чашки (№ 1 и № 2) вносили соответственно 0,1-2,0 и 2,0 мл ацетонового раствора. Растворитель испаряли в токе воздуха при комнатной температуре.

Идентификация методом ТСХ. Остаток в чашке № 1 растворяли в незначительном количестве ацетона и количественно переносили на линию старта пластины «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ в виде полосы. Рядом на линию старта наносили 5-10 мкл 0,08 % этанольного раствора вещества-стандарта. Хроматографировали, применяя подвижную фазу хлороформ-бензол (9:1). Хроматограммы проявляли в УФ-свете. 2,6-ДТБ-4-МГОБ идентифицировали по величине Rf.

Идентификация методом ВЭЖХ. Остаток в чашке № 2 растворяли в 10 мл ацетонитрила, раствор количественно переносили в мерную колбу на 20 мл и доводили до метки буферным раствором с рН 5,5. 20 мкл полученного раствора вводили в хроматограф «LC-20 Prominance» с матричным фотодиодным детектором (SPD-M20A). Хроматографировали в колонке Discovery® C18 HPLC Column, 5 мкм размерами 250×4.6 мм (Supelco) с предколонкой Discovery® C18 Supelguard™ Guard Cartridge Kit, 5 мкм размерами 20×4 мм (Supelco). Подвижная фаза – ацетонитрил-ацетатный буферный раствор pH 5,5 (0,04М CH3COONH4, CH3COOH) (7:3 по объёму), температура колонки 40оС, скорость потока элюента 1000 мкл/мин. Аналитическая длина волны – 280 нм. Определяли время удерживания анализируемого вещества.

Идентификация и количественное определение методом спектрофотометрии. После определения методом ТСХ вещество элюировали 10 минут из сорбента 5 или 10 мл этанола. Светопоглощение элюата исследовали в диапазоне 200-360 нм (спектрофотометр СФ-2000, длина оптического пути 10 мм). По оптической плотности элюата, измеренной при 282 нм, определяли количественное содержание 2,6-ДТБ-4- МГОБ спектрофотометрическим методом.

Результаты исследования

При идентификации методом ТСХ аналит проявлялся на хроматограммах в УФ-свете в виде темных пятен с величиной Rf 0,75±0,04, что соответствовало величине Rf вещества-стандарта.

Применяя     метод     ВЭЖХ,     2,6-ДТБ-4-МГОБ     идентифицировали     по     времени     удерживания (14,60±0,09). При определении методом УФ-спектрофотометрии по поглощению в этаноле анализируемое соединение идентифицировали по форме кривой спектра и положению максимумов полос поглощения. Спектр вещества, извлекаемого из биоматериала, в каждом случае был близок спектру вещества-стандарта. В УФ-спектре 2,6-ДТБ-4-МГОБ, изолированного из биологического материала на различных сроках сохранения, как и в УФ-спектре стандартного вещества, присутствовала длинноволновая полоса в области 282±2 нм. Уравнение градуировочного графика для УФ-спектрофотометрического определения 2,6-ДТБ-4- МГОБ имело вид: А = 0,009882∙С-0,004147, где А – оптическая плотность, С – концентрация вещества в фотометрируемом растворе (мкг/мл). Относительная ошибка среднего результата при определении 2,6-ДТБ- 4-МГОБ выбранным методом ˂ 0,9 % (n=6; Р=0,95).

Результаты определения 2,6-ДТБ-4-МГОБ на различных этапах сохранения модельных смесей отражены на рисунке.

Как свидетельствуют данные рисунка, продолжительность сохранения исследуемого соединения в гнилостно разлагающемся биоматериале уменьшается с ростом температуры. Наиболее длительный срок сохранения 2,6-ДТБ-4-МГОБ (382 суток) соответствует температурному режиму 0-2оС. Уменьшение длительности сохранения (318 суток) отмечается при увеличении температуры до 8-10оС. Минимальный период (282 суток), в течение которого ещё можно определить исследуемое соединение в биоматериале, соответствует температуре 20-22оС.

Выводы

1.    Изучен характер сохраняемости 2,6-ди-трет-бутил-4-метилгидроксибензола в биологическом материале при трёх различных температурах.

2.    Установлено, что при температурах 0-2оС, 8-10оС и 20-22оС продолжительность сохранения рассматриваемого соединения составляет 382, 318 и 282 суток.

Список литературы

1.   Быков, В.А. Разработка лекарственного средства для гинекологии в виде овулей с дибунолом и экстрактом прополиса / В.А. Быков, Ю.В. Шикова, С.Б. Бахтиярова // Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация. – 2004. – № 2. – 169-171.

2.         Колесников, А.В. Синтетический прямой антиоксидант ионол как перспективное антикатарактальное средство. Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова / А.В. Колесников // 2012. – № 3. – С. 160-167.

3.    Определение карбофурана при судебно-химическом исследовании биологического материала / В.К. Шорманов, Е.А. Коваленко, Е.П. Дурицын [и др.] // Судебно-медицинская экспертиза. – 2013. – Т. 56, № 4. – С. 30-34.

4.         Пугачёва, О.И. Особенности распределения 2,4- и 2,6-диметильных производных гидроксибензола в организме теплокровных животных / О.И. Пугачёва, А.П. Асташкина, В.К. Шорманов, М.А. Останин // Судебно-медицинская экспертиза. – 2014. – Т. 57, № 4. – С. 44-48.

5. Судебно-химическое определение фурадана / В.К. Шорманов, В.П. Иванов, В.А. Королев [и др.] // Судебно-медицинская экспертиза. – 2005. – Т. 48, № 3. – С. 27-31.

6.     Шорманов, В.К. Особенности распределения 2,6-ди-трет-бутил-4-метилгидроксибензола в организме теплокровных животных / В.К. Шорманов, О.И. Пугачёва, А.П. Асташкина, Е.П. Цацуа // Судебно-медицинская экспертиза. – 2016. – Т. 59, № 1. – С. 29-34.

7.    Hanada, Н. Phenolic antioxidant 2,6-di-tert-butyl-p-cresol (vitamin E synthetic analogue) does not inhibit 1,1'-dimetyl-4,4'-bipyridium dichloride (paraquat)-induced structural chromosomal damage in cultured leukocytes of the dark-spotted-frog Pelophylax (Rana) nigromaculatus / Н. Hanada // Hereditas. – 2012. – 149. – Vol. 5. – P. 173-177.

8.   Podolina, E.A. Determination of ionol in oils in the presence of low-molecular-weight phenols using reversed-phase HPLC / E.A. Podolina, O.B. Rudakov, E.A. Khorokhordina, A. M. Grigor’ev // Journal of Analytical Chemistry. – 2008. – Vol. 63, N 6. – P. 548-550.