18 июня 2017г.
Актуальность проблемы.
В кардиохирургии успешно применяется операция трансмиокардиальной реваскуляризации, выполняемая с использованием высокоинтенсивных лазеров (ТМЛР) [1,2,6] Однако, до сих пор отсутствует ясность понимания механизмов стимуляции лазером процессов неоангиогенеза [5,7]. Одна из первых клеточных популяций, реагирующих на лазерное воздействие, это тучные клетки [3,8]. Их дегрануляция и миграция в миокард являются триггерным моментом формирования новой сосудистой сети [6,9].
Ряд исследователей полагает, что в повышении функциональной активности тучных клеток ведущую роль играют нейропептиды, такие как субстанция Р и кортикотропин-релизинг фактор (КРФ) [4,10,13]. Установлено, что на ранних этапах повреждения субстанция Р выступает дегранулятором мастоцитов [11,12], однако экспрессия субстанции Р и КРФ и влияние этих нейропептидов на реакции тучных клеток после повреждения сердца до сих пор не изучались.
Цель исследования - изучение особенностей экспрессии субстанции Р, кортикотропин-релизинг фактора и морфофункционального состояния тучных клеток при лазерном и механическом хирургическом повреждении сердца крыс.
Материалы и методы исследования.
Эксперимент проведен на 80 беспородных крысах.
Каждая группа экспериментальных животных соответствовала конкретному сроку выведения из опыта (1 минута, 1 час, 1 сутки, 5 суток) и состояла из 10 особей.
Диффузные ишемические повреждения в миокарде крыс моделировали созданием гиподинамического стресса. Хирургическое повреждение миокарда моделировали лазерным воздействием либо механически- инъекционной иглой Использовался диодный лазер Альто-300 (Россия), длина волны 805 нм. Применялась мощность 5 Вт в непрерывном режиме.
После стандартной гистологической проводки, приготовления парафиновых блоков, срезы тканей окрашивались гематоксилином-эозином. Тучные клетки окрашивались толуидиновым синим (рН 2,0). Определение уровня экспресии кортикотропин-релизинг фактора и субстанции Р проводилось с помощью иммуногистохимического метода с использованием специфических антител к субстанции Р и КРФ и системы мечения Immu-markTM (ICN) на основе конъюгата вторых антител с биотином – стрептавидином – щелочной фосфатазой. Производился подсчет относительной площади экспрессии фермента.
Математические расчеты осуществлялись с помощью комплекта компьютерных программ Statistica 6.1 , Диаморф Цито®, Диаморф Ипсо®.
Результаты исследований и их обсуждение.
После повреждения ишемизированного миокарда имелось достоверное нарастание индекса экспрессии субстанции P с первых минут опыта до срока 1 сутки. Максимальное увеличение индекса экспрессии субстанции P отмечалось на сроке 1 час в группе лазерного воздействия на ишемизированный миокард (34,28±0,89 у.е.). Этот показатель достоверно отличался от показателей в аналогичной группе с механическим воздействием на ишемизированный миокард (22,26±0,71 у.е.).
Достоверное нарастание индекса экспрессии КРФ отмечалось в обеих группах на сроках 1 сутки и 5 суток, при этом в группе животных, у которых формировался лазерный канал, эти показатели были достоверно выше (34,02 ±1,02), чем в группе с механическим воздействием (21,59 ±1,0).
Максимальные значения индекса дегрануляции тучных клеток (Д/(Д+Н)) в ишемизированном миокарде относились к срокам 1 минута и 1 час после повреждения (76,6±2,1% лазер, 59,6±2,3% механическое повреждение) В последующем происходило снижение индекса дегрануляции, несколько менее выраженное в группе с лазерным воздействием (59,3±3,4% и 38,7±3,4% соответственно). Достоверные отличия показателей индекса дегрануляции мастоцитов между группами животных с лазерным и механическим повреждением сердца также отмечались на всех сроках исследования до 5 суток .
Общее количество тучных клеток, в зонах локализации КРФ и субстанции Р, после повреждения сердца также характеризовалось определенной временной динамикой. После лазерного повреждения имелось нарастание количества тучных клеток на сроке 1 час и отсутствием достоверных отличий с контролем к 5 суткам, после механического повреждения миокарда отличия отмечались только на сроке 1 час.
В ишемизированном миокарде в первые минуты после лазерного воздействия отмечалось лишь некоторое увеличение тучных клеток с третей степенью дегрануляции (с 5 до 17%), а к пятым суткам, наряду с нарастанием целых тучных клеток, содержание тучных клеток с третей степенью дегрануляции сокращалось до 1%. При механическом воздействии на миокард картина была схожей с описанной выше.
Анализ полученных результатов показал, что между показателями экспрессии нейромедиаторов, уровнем дегрануляциии и количеством тучных клеток существовали следующие корреляционные зависимости:
Сильные отрицательные корреляционные связи (p<0,05) были выявлены между уровнем экспрессии субстанции Р и содержанием тучных клеток с 1 степенью дегрануляции.
Сильные положительные корреляционные связи (p<0,05) были выявлены между уровнем экспрессии субстанции Р и содержанием тучных клеток с 2 и 3 степенью дегрануляции, индексом дегрануляции тучных клеток, количеством тучных клеток после лазерного повреждения миокарда.
Сильные отрицательные корреляционные связи (p<0,05) были выявлены между уровнем экспрессии кортикотропин-релизинг фактора и содержанием тучных клеток с 2 степенью дегрануляции после лазерного повреждения миокарда, содержанием тучных клеток с 3 степенью дегрануляции, индексом дегрануляции тучных клеток после лазерного воздействия.
Положительные корреляционные связи (p<0,05) были выявлены между уровнем кортикотропин- релизинг фактора и содержанием тучных клеток с 1 степенью дегрануляции.
Полученные нами результаты показали, что реакция субстанции Р и кортикотропин-релизинг фактора на ранних этапах развития воспаления после повреждения миокарда высокоинтенсивным лазером или механическим путем взаимосвязаны с реакцией тучных клеток и началом процессов неоангиогенеза. Первоначальный этап ответа ткани на повреждение (первые сутки) характеризуется повышением уровня экспрессии субстанции Р и интенсивной дегрануляцией тучных клеток, вплоть до тотального выхода гранул из клетки. К пятым суткам происходит постепенное нарастание экспрессии кортикотропин-релизинг фактора, сопровождаемое снижением содержания дегранулированных форм тучных клеток, ростом относительной площади сосудистого русла и количества микрососудов в миокарде, что свидетельствует о начале процессов неоангиогенеза.
Таким образом, хотя оба исследованных нейропептида влияют на процессы дегрануляции мастоцитов, но это воздействие в случае хирургического повреждения миокарда значительно отличается по временным и качественным показателям, что характеризует влияние субстанции Р в поврежденном миокарде как фактор альтерации, а кортикотропин-релизинг фактор – как адаптогенный пептид. Полученные нами факты подтверждаются данными литературы о влиянии нейропептидов на состояние тучных клеток и ответную реакцию тканей [11,12,13] и свидетельствуют о необходимости дальнейшего изучения взаимодействия мастоцитов и нервных волокон.
Список литературы
1. Головнева Е.С. Динамика уровня основного фактора роста фибробластов в процессе неоангиогенеза, стимулированного воздействием высокоинтенсивного лазерного излучения//Бюллетеньэкспериментальнойбиологииимедицины. 2002. Т. 134.№7. С. 109-111.
2. Головнева Е.С., Козель А.И., Попов Г.К. Патофизиологический механизм реваскуляризации тканейспомощьювоздействиявысокоинтенсивноголазерногоизлучения //ВестникРоссийской академиимедицинскихнаук. 2003.№6. С. 23-26.
3. Головнева Е.С. Патофизиологическое обоснование действия высокоинтенсивного лазера на миокард с целью стимулирования процесса неоангиогенеза в сердечной мышце //автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук / Челябинский гос. мед. институт, Челябинск, 1999.
4. Головнева Е.С., Попов Г.К., Синцов Д.Л. Роль нейропептидов в регуляции морфофункциональногосостояниятучныхклетокприхирургическомповреждениимиокарда // Вестникновыхмедицинскихтехнологий. 2007. Т. 14. №2. С. 25-26.
5. Головнева Е.С., Попов Г.К. Неоангиогенез как универсальный ответ тканей на высокоинтенсивное лазерное воздействие// В сборнике: Лазерные технологии в медицине. Челябинск, 2001. С. 108-112.
6. Головнева Е.С. Динамика активности протеолитическихферментов впроцессе неоангиогенеза, стимулированного воздействием высокоинтенсивного лазерного излучения // Вестник новых медицинскихтехнологий. 2002. Т. 9. №3. С. 36-371
7. Головнева Е.С., Попов Г.К. Экспрессия фактора роста сосудистого эндотелия при формировании новой сосудистой сети под воздействием высокоинтенсивного лазерного излучения // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003. Т. 136. № 12. С. 624-626.
8. Asadi S, Alysandratos KD, Angelidou A. Substance P (SP) induces expression of functional corticotropin-releasing hormone receptor-1 (CRHR-1) in human mast cells.// J Invest Dermatol. 2012 Feb;132(2):324-9.
9. Cao J. Human mast cells express corticotropin-releasing hormone (CRH) receptors and CRH leads to selective secretion of vascular endothelial growth factor // J. Immunol.-2005.-Vol.174(12).-P.7665- 7675.
10. Kozel A.I., Popov G.K., Golovneva E.S., Belskii M.S. Reaction of myocardial mast cells during neoangiogenesis induced by YAG:ND laser //Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 1998. Т. 126. №7. С.746-747.
11. Overman EL, Rivier JE, Moeser AJ. CRF induces intestinal epithelial barrier injury via the release of mast cell proteases and TNF-α.// PLoS One. 2012;7(6):e39935.
12. Terui K. Coronary vasodilation and positive inotropism by urocortin in the isolated rat heart / K. Terui, A. Higashiyama, N. Horiba et. al. // Journal of Endocrinology.-2001.-Vol.169.-P.177-183.
13. Theoharides TC, Stewart JM, Panagiotidou S, Melamed I. Mast cells, brain inflammation and autism.//Eur J Pharmacol. 2016 May 5;778:96-102.
