ИССЛЕДОВАНИЕ МУТАЦИЙ ГЕНА Р53 НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ РАЗВИТИЯ РАКА ЛЕГКОГО У РАБОТНИКОВ ПО «МАЯК»

Аннотация
Проведено молекулярно-генетическое исследование механизмов развития рака легкого на разных стадиях его формирования у работников ПО «Маяк» с использованием архивных фиксированных в формалине парафиновых блоков (ФФПБ).
На данном биоматериале проведен скрининг и изучение мутаций 5, 7 и 8-ого экзонов гена р53. Мутации гена р53 методом TTGE и секвенирования обнаружены в 25% пролиферативных и 20% предопухолевых изменений ткани легкого, и в 40% случаев рака легкого.
Введение
Как показано в эпидемиологических исследованиях, радиационное воздействие приводит к повышенному риску лейкемии и солидных опухолей у человека [1, 4]. Исследования когорты работников предприятия атомной промышленности ПО «Маяк» показали повышение риск рака легкого, печени и скелета у работников, подвергшихся внутреннему альфа-облучению от инкорпорированного Pu-239 [2]. В развитии рака легкого большое значение имеет опухолевой ген-супрессор p53, играющий ключевую роль в интеграции сигналов повреждающего воздействия на ДНК [7]. При изменении его функционирования происходит нарушение контроля повреждений ДНК и осуществления апоптоза, что приводит к нестабильности генома и может играть определенную роль в развитии рака.
Центральный ДНК-связывающий домен гена р53, включающий 5 – 8 экзоны, играет важную роль в проявлении транскрипционной активности гена р53. Именно в этих экзонах, по литературным данным, возникает 90% мутаций, выявляемых в злокачественных новообразованиях у человека [9].
Целью настоящего исследования является оценка мутационных событий в 5, 7 и 8 экзонах гена р53 в морфологически верифицированных случаях измененной (пролиферативные и предопухолевые изменения, рак легкого), а также гистологически неизмененной ткани легкого работников, подвергшихся профессиональному облучению.
Методы исследования
Молекулярно-генетическое исследование было проведено на полученных при аутопсии биологических образцах ткани легкого, фиксированных формалином, залитых в парафиновые блоки (ФФПБ), хранящихся в радиобиологическом репозитории тканей человека (РРТЧ) Южно-уральского института биофизики [3]. Для исследования были подобраны верифицированные случаи рака легкого – 5 случаев, предопухолевые изменения (дисплазии) – 5 случаев, пролиферативные изменения (гиперплазии) 4 случая. Контроль был представлен неизмененными участками ткани легкого этих же случаев.
ДНК выделяли с помощью набора QIAamp DNA FFPE Tissue Kit («QIAGEN», Германия) согласно протоколу производителя [11]. Качество и количество выделенной ДНК оценивали методом спектрофотометрии. Изучение мутационного процесса проводили в 5, 7 и 8 экзонах гена р53 с использованием метода TTGE и секвенирования. Для увеличения количества анализируемых фрагментов использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Детекцию продуктов амплификации проводили с помощью метода TTGE (гель- электрофореза продуктов реакции ПЦР при временном градиенте температуры), позволяющего обнаружить наличие/отсутствие мутаций [5]. При обнаружении мутаций в исследуемых фрагментах методом TTGE, определяли их вид и место локализации с помощью секвенирования с применением шестнадцатикапиллярного секвенатора (“Applied Biosystems”, США).
Статистическую значимость различий оценивали с помощью критерия Стьюдента (при р≤ 0,05). Результаты
В Табл.1 представлены характеристики доноров, бывших работников ПО «Маяк», привлеченных к исследованию, с верифицированными пролиферативными (группа 1) и предопухолевыми (группа 2) изменениями ткани легкого, и раком легкого (группа 3) [8].

Примечание: р – уровень значимости различий по отношению к 1 группе; M ± m2 – средняя арифметическая и стандартное отклонение.

Из Табл.1 видно, что в группе случаев рака легкого средняя поглощенная доза внутреннего альфа- облучения от инкорпорированного Pu-239 в легких была наибольшей по сравнению с другими группами. Статистически значимо отличался и индекс курения в группе случаев рака от показателей в других группах. Статистически значимых различий по полу и возрасту на момент смерти между исследуемыми группами не выявлено.
Для проведения молекулярно-генетического анализа, из ФФПБ архивной ткани легкого выделили ДНК, количественный выход которой существенно варьировал в пределах 9,30 – 549,50 нг/мкл, что связано с историей получения, фиксации и хранения данного блока. Для исследования на наличие мутаций в гене р53 были выбраны экзоны 5, 7 и 8, характеризующиеся повышенной частотой мутаций при развитии рака различной локализации.
На начальном этапе исследования для выявления мутаций в 5, 7 и 8 экзонах гена р53, использовали TTGE
анализ, в результате чего было обнаружено 6 мутаций (Табл.2).

                                                                                                                      Таблица 2
Мутации, обнаруженные в 5, 7 и 8-ом экзонах гена р53

Примечание: группа 1 – пролиферативные изменения; группа 2 – предопухолевые изменения; группа 3 – рак легкого.

Следующий этап исследования заключался в подтверждении обнаруженных методом TTGE мутаций наиболее точным методом – секвенированием. При секвенировании 5, 7 и 8 экзонов, одна мутация (5-ый экзон, образец №7), обнаруженная методом TTGE, не подтвердилась. Кроме того, в случае №39 методом секвенирования была выявлена мутация, не обнаруженная TTGE анализом (Табл.2).
Результатом исследования явилось наличие 6 мутаций в экзонах 5, 7 и 8 гена р53, подтвержденных секвенированием (табл.2). Все выявленные мутации были трансверсиями (замена пурина на пиримидин или наоборот), что указывает на воздействие экзогенных мутагенов [6]. Кроме того отмечено увеличение количества мутаций в группе случаев рака легкого по сравнению с другими группами (Табл.2). Общее число случаев в группах с пролиферативными и предопухолевыми изменениями ткани легкого, и группе с раком легкого, в которых были обнаружены мутации гена р53, составило 25%, 20%, и 40% соответственно.
Заключение
Исследован мутационный процесс в 3-х из 11 экзонов гена р53 (5, 7, 8 экзоны центрального домена гена). Мутации были обнаружены в 25% пролиферативных и 20% предопухолевых изменений ткани легкого, и в 40% случаев рака легкого. Полученные данные соответствуют данным других исследователей о том, что мутации гена р53 при раке легкого наблюдаются в 40 – 70% случаев [10].

Список литературы

1. Egawa H., Furukawa K., Preston D., Funamoto S., Yonehara S., Matsuo T. et al. Radiation and Smoking Effects on Lung Cancer Incidence by Histological Types Among Atomic Bomb Survivor // Rad. Res. – 2012. – Vol. 178.
– N. 3. – P. 191–201.
2. Gilbert E.S., Sokolnikov M.E, Preston S. J. Schonfeld S.J., Schadilov A.E., Vasilenko E.K. et al. Lung Cancer Risks from Plutonium: An Updated Analysis of Data from the Mayak Worker Cohort // Rad. Res. – 2013. – Vol. 179. – N. 3. – P.332–342.
3. Muksinova K.N., Kirillova E.N., Zakharova M.L., Revina V.S., Neta R. Bio-specimens Repository from Mayak workers exposed to protracted radiation // Health Physics. – 2006. – V. 90. – N. 3. – P. 263–265.
4. Sokolnikov M.E., Gilbert E.S., Preston D.L., Ron E., Shilnikova N.S., Khokhryakov V.V. et al. Lung, liver and bone cancer mortality in Mayak workers // Int. J. Cancer. – 2008. – V. 123. – N. 4. – P. 905–911.
5. Sorli T., Johnsen H., Vu P., Lind G.E., Lothe R., Børresen-Dale A.L. Mutation screening of the TP53 gene by Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis // «Methods in Molecular Biology», Molecular Toxicology Protocols. – 2005. – V.291. – P.207–216.
6. The p53 Mutation handbook // By Soussi T., Rubio-Nevado J.M., Hamroun D. and Beroud C. – 2007 – version 1.
7. Trott K.R., Rosemann M. Molecular mechanisms of radiation carcinogenesis and the linear, non-threshold dose response model of radiation risk estimation. // Radiation and Environmental Biophysics. – 2000. – V. 39 – N. 2. – P. 79–87.
8. Азизова Т. В., Сумина М. В., Беляева З. Д., Дружинина М. Б., Семенихина Н. Г., Стеценко Л. А. и др. Структура и характеристика медико-дозиметрической базы данных «Клиника» // Вопросы радиационной безопасности. – 2006. – Спецвыпуск 2. – С. 55–65.
9. Желтухин А. О. и Чумаков П. М. Повседневные и индуцируемые функции гена р53 // Успехи биологической химии. – 2010. – Т. 50. – С. 447-516.
10. Коган Е.А. Молекулярно-генетические и иммуногистохимические особенности рака легкого // Руководство по иммуногистохимической диагностики опухолей человека /Под редакцией С.В. Петрова и Н.Т. Райхлина.– Казань: Титул, 2004. – С.61–66
11. Техническая инструкция по использованию набора QIAamp DNA Tissue Kit – № 56404 – 2009.