Новости
09.05.2023
с Днём Победы!
07.03.2023
Поздравляем с Международным женским днем!
23.02.2023
Поздравляем с Днем защитника Отечества!
Оплата онлайн
При оплате онлайн будет
удержана комиссия 3,5-5,5%








Способ оплаты:

С банковской карты (3,5%)
Сбербанк онлайн (3,5%)
Со счета в Яндекс.Деньгах (5,5%)
Наличными через терминал (3,5%)

БЕЛОК DJ-1 В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТКАХ РАБДОМИОСАРКОМЫ ЧЕЛОВЕКА (ЛИНИЯ RD)

Авторы:
Город:
Москва
ВУЗ:
Дата:
01 января 2016г.

Одной из актуальных задач, решаемой современными медико-биологическими науками, является системное изучение белков в клетках злокачественных новообразований и поиск потенциальных биомаркеров. Значительный интерес при этом представляют исследования белков в клетках рабдомиосарком - опухолей, которые отличаются высокой злокачественностью и встречаются даже у детей [например, Orentas R.J. et al., 2012 и др.].
В лаборатории биомедицинских исследований Института биохимии им. А.Н. Баха РАН с 2009 г. с помощью протеомных технологий проводятся системные исследования белков в клеточных линиях, выведенных из различных злокачественных новообразований человека. При этом было выявлено несколько потенциальных белковых биомаркеров, в частности, известный онкобелок DJ-1 [например, Лисицкая К.В. с соавт., 2011 и др.].
За время, прошедшее после первых описаний этого белка, неоднократно публиковались данные о его повышенном содержании в клетках злокачественных новообразованиях эпителиального происхождения [например, Ley Y. et al., 2011 и др.]. Однако, среди доступной медико-биологической литературы (база данных PubMed и др.) не удалось обнаружить сведений о присутствии DJ-1 в рабдомиосаркомах и других злокачественных опухолях мезенхимального происхождения. Соответственно, целью данной работы стало изучение протеомного профиля и поиска белка DJ-1 в клетках рабдомиосаркомы человека линии RD.
Материалы и методы
Клетки линии RD (эмбриональная рабдомиосаркома человека) были приобретены в НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. Их выращивание для получения необходимой биомассы (10-20 106 клеток) проводили в среде DMEM, содержащей Hepes, пируват натрия, гентамицин и 12,5% эмбриональной телячьей сыворотки. Экстракцию клеточных белков, их фракционирование методом двумерного электрофореза по О`Фарреллу и детекцию полученных белковых фракций с последующим определением значений молекулярных масс (Mm) и изоэлектрических точек (pI) выполняли как описано ранее [Ковалева М.А. с соавт., 2009]. Цифровые изображения двумерных электрофореграмм получали сканированием (сканер Epson expression 1680) и редактировали в графическом редакторе из пакетов программ ImageMaster 2D Platinum версия 7 («GE Healthcare» Швейцария). Идентификацию белковых фракций осуществляли после трипсинолиза методами MALDI-TOF MS и MS/MS на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex («Bruker», Германия) как описано ранее [Ковалева М.А. с соавт., 2009]. Анализ полученных масс-спектров триптических пептидов выполняли с помощью программы Mascot («Matrix Science», США). О результатах идентификации судили по традиционным критериям: «coverage» - % покрытия полной аминокислотной последовательности белка выявленными пептидами и «score» - показатель соответствия выявленных пептидов с участками в полной аминокислотной последовательности идентифицируемого белка.
Результаты и обсуждение
На типичных двумерных электрофореграммах белков (Рисунок 1), экстрагированных из клеток рабдомиосаркомы линии RD, при окрашивании азотнокислым серебром выявлялось несколько сотен белковых фракций (до 600 по результатам компьютерного анализа изображений). Эти фракции располагались в широком диапазоне Mm и pI (большинство со значениями Mm от 10 до 95 кДа).
В целом, к настоящему времени в экстрактах из клеток рабдомиосаркомы удалось идентифицировать более 60 белков, среди которых оказались четыре известных онкобелка и, в частности, белок DJ-1 (Рисунок 1). Результаты масс-спектрометрической идентификации этих белков приведены в Табл.1.



Рис.1. Двумерная электрофореграмма клеток рабдомиосаркомы линии RD. Окраска азотнокислым серебром. Справа показаны белки-маркеры молекулярных масс в килодальтонах (kDa). Стрелками отмечены четыре идентифицированных онкобелка, включая DJ-1 (результаты идентификации приведены в Табл.1).

Так, еще около десяти лет назад Kanamori Tetal. (2004) сообщали о повышенном уровне белков семейства S100 и, в частности белка S100A11, в гладкомышечных опухолях, включая лейомиосаркомы. Важную роль статмина для выживания клеток остеосарком выявили недавно Carney B.K., Cassimeris L. (2010), и практически параллельно Liu X. et al. (2009) охарактеризовали изоформу L1 гидролазы С-концевого убиквитина (символ кодирующего гена UCH-L1) как потенциального биомаркера клеток остеосаркомы. Идентификация в данной работе белка DJ-1 протеомными технологиями на ДЭ белковых экстрактов из клеток рабдомиосаркомы человека линии RD, по-видимому, является первой информацией о присутствии этого белка в опухолевых клетках мезенхимального происхождения.
                                                                                                                             Таблица 1

 Результаты идентификации MALDI-TOF масс-спектрометрией четырех онкобелков из двумерных электрофореграмм белков рабдомиосаркомы линии RD человека.

 

Символ

 

Название белка

Номер в базе данных Protein NCBI

 

C / S*

 

Mm/pI эксп. **

Mm/pI теорет.

**

 

DJ-1

DJ-1 белок с сульфиновой кислотой

 

50513593

 

26 / 54

 

22,5/6,90

 

19,9/6,33

S100A11

Белок S100-A11

5032057

86 / 143

11,0/6,20

11,7/6,56

STMN1

Статмин, изоформа А

5031851

83 / 395

16,0/6,00

17,3/5,76

 

UCH-L1

Гидролаза С- концевого убиквитина, изоформа L1

 

21361091

 

83 / 145

 

24,0/5,45

 

24,8/5,33

* C / S - традиционные показатели идентификации, принятые в англоязычной литературе: Coverage - %
покрытия полной аминокислотной последовательности белка выявленными пептидами; Score - показатель соответствия или «счет очков».
** Mm/pI эксп. – значения Mm в килодальтонах и pI экспериментально определенные по соответствующим маркерам как описано ранее [Ковалева М.А. с соавт., 2009]; Mm/pI теорет. – расчетные значения, полученные с помощью программы Compute pI/Mw tool (http://web.expasy.org/compute_pi/) по сведениям о полных аминокислотных последовательностях указанных белков.

В настоящее время большое внимание уделяется белку DJ-1 как потенциальному маркеру различных патологических состояний, однако известно, что он присутствует и в нормальных клетках с разными типами дифференцировки. Установлено, что DJ-1 участвует в защите клеток от окислительного стресса, блокирует апоптоз, способствует повышению выживаемости клеток и может выполнять ряд других функций [например, Wilson M.A. 2011].
Таким образом, очевидно, что дальнейшие биомедицинские исследования белка DJ-1 как важного участника различных патологических и физиологических процессов представляют явный интерес, а их результаты могут иметь как теоретическое, так и прикладное значение.

Список литературы

1. Ковалева М.А. с соавт. Протеомный анализ белков скелетной мышцы (m. vastus lateralis) человека, идентификация 89 белковых продуктов генной экспрессии. // Биохимия, 2009, т.74 №11, 1524-1538.
2. Лисицкая К.В., с соавт. Изучение белка DJ-1 при раке простаты в образцах тканей, в культивируемых клетках и в сыворотке крови больных. // Биомед. химия 2011, т. 57, вып. 4. С.392-401.
3. Carney B.K., Cassimeris L. Stathmin/oncoprotein 18, a microtubule regulatory protein, is required for survival of both normal and cancer cell lines lacking the tumor suppressor, p53. // Cancer Biol. Ther. 2010. V.9. Р.699-709.
4. Kanamori T. et al. Increased expression of calcium-binding protein S100 in human uterine smooth muscle tumours. // Mol. Hum. Reprod. 2004. V.10. Р.735-742.
5. Lei Y., et al. Proteomics identification of ITGB3 as a key regulator in reactive oxygen species-induced migration and invasion of colorectal cancer cells. // Mol. Cell Proteomics.2011. Oct;10(10):M110.005397. doi: 10.1074/mcp.M110.005397.
6. Liu X., et al. Comparative proteomic analysis of osteosarcoma cell and human primary cultured osteoblastic cell. // Cancer Invest. 2009. V.27. Р.345-352.
7. Orentas R.J., et al.. Identification of cell surface proteins as potential immunotherapy targets in 12 pediatric cancers. // Front Oncol. 2012 Dec 17;2:194. doi: 10.3389/fonc.2012.00194. eCollection 2012.
8. Wilson M.A. The role of cysteine oxidation in DJ-1 function and dysfunction. // Antioxid. Redox. Signal. 2011. V.15. Р.111-122.