12 марта 2016г.
В молекулярной биологии эмбрионального развития экспрессию генов, как правило, изучают с помощью транскриптомных методов, таких как ОТ-ПЦР, нозерн-блот, in situ и Array гибридизация. По молчаливому согласию наличие или отсутствие определенных мРНК в клетке означает наличие или отсутствие соответствующего белка. Однако, существует масса свидетельств тому, что мРНК могут находиться в неактивных рибонуклеопротеидных комплексах, называемых по-разному, от информосом до стресс-гранул [1, 2]. Перечисленные методы не позволяют различать активные и неактивные формы мРНК, и, следовательно, не свидетельствуют о наличии соответствующего белка.
Целью настоящей работы было сравнение пространственного распределения мРНК и соответствующего белка в хвостах зародышей рыб (Danio reria) и лягушек (Xenopus laevis). Исследовались вентрализующие транскрипционные факторы: Xvent-2 в Xenopus laevis и Vox в Danio reria.
мРНК для этих белков, в частности, обнаруживается в хвостовой почке, являющейся индуктором образования тканей растущего хвоста.[4,5,6]. Мы решили выяснить, остаются ли клетки, синтезирующие белки Xvent-2 или Vox, в хвостовой почке, или они принимают участие в образовании тканей растущего хвоста. Для этого мы использовали антитела против белка Xvent-2, полученные нами в предыдущей работе [3], и антитела к белку Vox, полученные с применением синтетических полипептидов (по нашему заказу на фирме ALMABION, г. Воронеж) и провели иммуноокрашивание хвостов соответствующих зародышей. Кроме того, для более корректного сравнения мы провели in situ гибридизацию с пробами к соответствующим мРНК.
На Рисунке 1 приведены результаты in situ гибридизации с дигоксигенин-меченными пробами к мРНК Xvent2 (Рисунок 1 А), к антицепи Xvent2 (Рисунок 1 Б) и результаты иммуноокрашивания белка Xvent2 (Рисунок 1В) и контрольного окрашивания антителами к иммуноглобулину человека (Рисунок 1Г). Как видно из рисунка, мРНК Xvent-2 выявляется только в кончике хвоста, а белок распределяется вдоль хвоста, двумя тяжами, вверху и внизу.
Эти тяжи тянутся и далее вдоль осевых структур (данные не приведены). Аналогичная картина наблюдается и в зародышах Danio reria (Рисунок 2). мРНК vox выявляется в кончике хвоста, а белок Vox в кончике отсутствует, но хорошо виден вдоль осевых структур тела зародыша.
Для выяснения природы наблюдаемых тяжей, содержащих белок Xvent-2, изучены поперечные срезы иммуноокрашенных зародышей
Xenopus laevis. Подробно эта работа
опубликована ранее [7]. На Рисунке 3 приведен такой срез с указанием
расположения тканей и структур
хвоста. Видно, что окрашивание белка Xvent-2 (синий цвет) наблюдается вокруг,
а не внутри известных
структур (нотохорд,
нервная трубка, сосуды), в мезенхиме. Есть окрашивание и между сомитами
(данные не приведены).
Такая локализация клеток характерна для нервного креста, состоящего из мигрирующих стволовых клеток, дающих в дальнейшем ряд клеток
нервной системы и кожи. В теле зародышей
нервный крест образуется под индукцией нервного
валика. В хвосте эти клетки, видимо, могут появляться мигрируя из тела. Тогда не понятно, зачем в кончике хвоста хранится мРНК для белка, обнаруживаемого в этих клетках. Можно предположить, что клетки нервного гребня хвоста происходят
из стволовых клеток хвостовой
почки. Как только в стволовой клетке происходит синтез транскрипционного фактора Xvent-2 на запасенных матрицах, происходит перепрограммирование работы генома с участием
этого белка. В результате клетка становится подвижной и мигрирует вдоль хвоста.
Эти потоки миграции
мы и видим при окрашивании белка Xvent-2. В таком случае можно сказать,
что синтез факторов
транскрипции семейства Vent на запасенных матрицах стимулирует переход плюрипотентных клеток
хвостовой почки зародышей к дифференцировке в мигрирующие стволовые
клетки следующего порядка.
Наша работа подтверждает, что присутствие каких-либо
мРНК в определенных клетках еще не является свидетельством того, что в этих клетках синтезируется соответствующий белок.
Любой транскриптомный анализ должен сопровождаться протеомным анализом, включающим анализ как присутствия, так и активности соответствующего белка.
Работа поддержана грантами немецкого
научно-исследовательского сообщества (DFG) ON86/3-1 и РФФИ № 14-54 12008.
Список литературы
1.
Воронина А.С. (2002).
Молекулярная биология,
36,956-969.
2.
Воронина А.С.. Пшенникова Е. С. (2010). Молекулярная биология, 44 №4: 591–600.
3.
Пшенникова Е.С., Воронина А.С. (2008).
Молекулярная биология, 42(6),
1012-1017.
4.
Gilardely C.N., Pozzoli O., Sordino
P., Matassi G., Cotelli1
F. (2004) Developmental Dynamics
230:494–508,
5.
Melby A.E., Beach C, Mullins
M. Kimelman D. (2000)
Developmental Biology
224, 275–285
6.
Onichtchouk D, Gawantka V, Dosch R, Delius H, Hirschfeld
K, Blumenstock C, Niehrs C. (1996). Development 122: 3045-3053
7.
Pshennikova
E., Goncharenko A.,
Voronina A. (2014) Indian Journal of Fundamental and Applied Life Sciences 4 (3) 180-187.
