ПРИМЕНЕНИЕ МИКРОФЛУОРИМЕТРИИ И СПЕКТРОСКОПИИ КОМБИНАЦИОННОГО РАССЕЯНИЯ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ И КОНФОРМАЦИИ ПИГМЕНТОВ В КЛЕТКАХ ВОДОРОСЛИ РОДА CLADOPHORA

Резюме: С помощью спектроскопии комбинационного рассеяния (КР) и микрофлуориметрии исследовали клетки водоросли рода Cladofora. Установлено, что в исследуемых клетках наблюдается неравномерное распределение молекул хлорофилла, связанное с различной функциональной активностью фотосинтеза. Выявлено наличие положительной корреляции между снижением флуоресценции хлорофилла и ростом упорядоченности структуры молекул каротиноидов. Обсуждается механизм участия каротиноидов в регуляции флуоресценции хлорофилла в различных областях клетки водоросли.

Введение. Известно, что одними из важнейших составляющих компонентов фотосинтетического аппарата эукариотических организмов, без которых невозможен процесс фотосинтеза являются хлорофиллы и каротиноиды. Молекулы хлорофиллов а и b представляют собой производные порфирина, включающие циклопентаноновое кольцо, конденсированное с порфириновым макроциклом, центральный атом Mg и различные заместители. Эти пигменты и каротиноиды входят в состав светособирающих комплексов ФС1 и ФС2 и участвуют в светосборе, но и также в функции светосбора не последнюю роль играют каротиноиды [1].

Когда уровень освещенности мал, то большинство адсорбированных фотосистемами фотонов используются в первичных реакциях фотосинтеза, но при высоких интенсивностях светового потока ФСА, чтобы избежать негативного воздействия избыточной энергии используется модификация молекул каротиноидов фотосинтетической мембраны тилакоида. Эти каротиноиды связанных непосредственно с белками ФС, приводящих к тепловой диссипации энергии поглощенных светособирающими комплексами квантов света (цикл ксантофилла) [1,3,4, 7,8, 13,17].

Известно, что картиноиды способны к тушению возбужденных триплетных форм хлорофилла и дезактивации активных форм кислорода, продуцируемых, в основном, триплетной формой хлорофилла, [1,2,16]. Однако, каротиноиды ФСА тилакоидов в большей степени подвержены фотодеструкции, так как контактируют с реакционно-способными метаболитами (Хл, компоненты ЭТЦ, генерирующие АФК и др.) это каротиноиды первого пула [20].

В зеленых (микро) водорослях первичные каротиноиды локализованы в фотосинтетической мембране, связаны с протеинами ФСА, в ССК как и других видов фотосинтетиков, вторичные каротиноиды локализованы в виде пластоглобул (экстратилакоидных и цитоплазматических липидоглобул) и нередко встречаются каротиноиды в свободной форме в виде эфиров ксантофиллов и жирных кислот[1, 18, 20].

Цель настоящей работы  заключалась в проведении сравнительного исследования локализации и конформации пигментов в клетках водорослей рода Cladofora.

Объект и методы исследования. Объектами исследования служили водоросли трех видов культуры Cladophora rivularis, Cladophora glomerata и Cladophora aegagropila выращенные при комнатной температуре. Исходным посевным материалом явились части таллома кладофоры.

Оптическая микроскопия. Приготовленный препарат изучался под микроскопом Micros MC 100 (TS), Video Set (Австрия). Прибор представлен тринокулярным микроскопом MC 100 (TS), профессиональной видеокамерой CAM V300, Vision, видеоадаптером 0,5х (C-Mount), цветного TFT монитора высокого разрешения 15".

Спектроскопия комбинационного рассеяния света. Микроспектрофлуориметрия Препараты водорослей изучались с помощью конфокального рамановского дисперсионного спектрометра inVia фирмы Renishaw (UK), представленного на основе конфокального микроскопа исследовательского класса Leica DM 2500, оборудованного встроенной видеокамерой и ручным координатным столиком с минимальным шагом движения по осям X и Y – 100 нм. Лазер 532 нм (максимальная мощность 500мВт); система регистрации сигнала КРС и флуоресценции представляет собой CCD- детектор с Пельтье охлаждением до -70°С, дифракционная решетка 1800 штрихов /мм со спектральной шириной 1000 см-1и разрешающей способностью 1см-1. Ровный фрагмент водоросли помещался предметное стекло и затем подвергался микроскопированию, с последующей записью спектра КР и сигнала флуоресценции. Накопление сигнала производилось в течение 10 секунд при мощности излучения лазера 5мВт (для регистрации КРС спектров) и 1 секунда при мощности излучения лазера 0,25мВт (для регистрации сигнала флуоресценции). Получение и первичная обработка спектров КРС и флуоресценции производилась в программе WIRE, далее обработка полученных спектров велась с помощью пакета программ Origin 8.1.

Флуоресцентная спектроскопия. Регистрация спектров флуоресценции хлорофилла проводилась на спектрофлуориметре RF-5301PC (Shimadzu, Япония). В качестве источника излучения применялась 150 W ксеноновая лампа с деозонатором; погрешность по шкале длин волн не более ± 1,5 нм. Флуоресценцию хлорофилла возбуждали светом с длиной волны 410 нм (полоса Соре).

Результаты и их обсуждение. Известно, что интенсивность флуоресценции определяется температурой, рН и другими факторами среды обитания водоросли. Следует отметить, что интенсивность флуоресценции хлорофилла в клетке намного ниже, чем в растворе, но, тем не менее, небольшая часть энергии электронного возбуждения (не более 3%) переходит в энергию света флуоресценции в виде так называемой фоновой флуоресценции F0. Как правило, в нормальных условиях величина F0 мала, что говорит об активном использовании клетками энергии поглощенного света. Но если при стрессовом воздействии нарушается состояние фотосинтетических мембран, то центры (РЦ) переходят в неактивное (закрытое) состояние, когда происходит прекращение потока электронов в первичных процессах фотосинтеза. В этих условиях поглощенная энергия света уже не может использоваться в фотосинтезе, поэтому и флуоресценция хлорофилла возрастает [21].

В ходе проведенного исследования установлено, что максимальная интенсивность фоновой флуоресценции (при 665 нм) наблюдается у Cladophora glomerata (198,5 отн. ед.), а минимальная – у Cladophora rivularis (143,7 отн. ед.) и Cladophora aegagropila (149,4 отн. ед.) (Рисунок 1).

В следующей серии экспериментов было зарегистрировано распределение флуоресценции хлорофилла по клетке кладофоры с разрешением 3,5мкм по осям X и Y (Рисунок 2). Установлено, что распределении сигнала флуоресценции пигментов в клетке кладофоры гетерогенное. Отметим, что в клетке максимальная флуоресценция пигментов выявлена (желтый и красный цвет) ближе к центру клетки. Вероятно, что в тех областях клетки где наблюдается максимальная флуоресценция сосредоточено большее количество пигмента хлорофилла, либо же с меньшей эффективностью происходят первичные процессы фотосинтеза из-за состояния ЭТЦ.

Аналогичные результаты получены и на клетках двух других водорослей, в связи с этим следующим этапом работы стало выяснение молекулярных свойств каротиноидов водорослей рода Cladophora, потому что они зависят от состояния хлорофилла, а следовательно, и его флуоресценции.

В следующей серии экспериментов исследовались спектры КР водорослей - Cladophora aegagropila, Cladophora rivularis и Cladophora glomerata.

В спектре КР в области 900-1600 см-1 водорослей рода Cladophora были идентифицированы следующие колебания молекулярной структуры, характерные для каротиноидов (Рисунок 3):

· пик ~1521 см-1 характеризующий валентные колебания двойных -С=С--связей молекулы каротиноида [9,14];

· пик ~1156 см-1 характеризует валентные колебания C-C связей. При транс-конформации двойных связей каротинода пик 1156 имеет два ярко выраженных плеча с положениями 1190-1193 см-1 и 1210 см-1. Кроме этого, при цис-транс переходе увеличивается полуширина полосы 1521 см-1[15];

·   пик около 1004 см-1 спектра КРС характеризует валентные колебания боковой метильной группы C- СН3[9, 19];

·   пик ~ 960 см-1 характеризует внеплоскостные колебаниями С-Н около С-С связи, причем увеличение интенсивности данной полосы наблюдается при нарушении плоской конфигурации молекулы, чем большее количество пигмента связано с белком, тем менее выражены внеплоскостные кручения между С11 – С12 атомами углерода соответственно и интенсивность данной полосы [2].

Также отмечается слабое  усиление полосы около ~1130 см-1 у всех видов водоросли, что говорит о предрасположенности к cis-изомеризации молекул каротиноидов [2]. Других изменений в положении полос не было зафиксировано.

Для того чтобы достоверно определить, невидимые на первый взгляд, изменения положения полос использовался такой критерий как измерение полуширины полос [10] (т.е. ширина полосы, при которой её интенсивность равна половине максимальной).

Таблица 1 Полуширина основных, анализируемых полос спектра КР каротиноидов водорослей рода Cladophora.

Полоса, см-1	Полуширина полосы, см-1
	Cl. aegagropi- la	±	Cl. glomera- ta	±	Cl. rivula-ris	±
960,67	21,60	1,08	22,60	0,90	22,87	0,98
1004,23	16,25	0,65	14,99	0,51	14,68	0,73
1155,49	17,16	0,77	14,46	0,65	13,94	0,61
1521,64	19,40	0,97	19,49	0,94	17,76	0,68

Согласно полученным результатам (Табл.1) выявлено уменьшение полуширины полосы 1521 см-1 у Cl.rivularis по сравнению с двумя другими видами, а также наблюдается тенденция к сдвигу полосы 1521 см-1 у Cl.rivularis относительно той же полосы у Cl. aegagropila и Cl. glomerata. Обнаружено уменьшение полуширины полосы 960 см-1 у Cl. aegagropilia относительно Cl. glomerata и Cl.rivularis на 1,00 и 1,26 см-1 соответственно. Также у Cl. aegagropila наблюдается увеличение полуширины полосы 1155см-1 относительно тех же полос у Cl. glomerata и Cl.rivularis на 2,70 см-1 и 3,23 см-1 соответственно (Табл.1). Эти данные также могут свидетельствовать о тенденции к изменению положения полос 960, 1004 и 1155см-1 у Cl. aegagropila относительно положения тех же полос у двух других видов.

На основе анализа интенсивности полос 1521, 1152, 1003 и 960 см-1 спектра КР были выявлены следующие изменения в молекулярной структуре каротиноидов.

Исходя из анализа соотношения полос 1521/1152 (Рисунок 4), можно говорить о том, что, вероятно, у видов Cl. aegagropila и Cladophora rivularis каротиноиды находятся в более плотном микроокружении либо [10] в фотосинтетической мембране, антенных комплексах, комплексах с белком белках либо в пластоглобулах [6,7,20], чем у Cl. glomerata. Также можно проследить связь между увеличенными соотношениями полос 1521/1152 у Cl. aegagropila и Cladophora rivularis и сниженными значениями флуоресценции хлорофилла (Рисунок 4) у этих же видов, вероятно, это может быть связано с экранирующими свойствами каротиноидов находящихся в цитоплазме [20]. То есть, до молекул хлорофилла доходит меньше световой энергии, благодаря тому, что каротиноиды (как и вспомогательные пигменты типа антоцианов, билинов и др.) адсорбируют ее и переводят в тепло, чтобы предотвратить фоторазрушение. Возможно, в такой «упорядоченной форме молекулы» каротиноиды (вне зависимости от места положения в клетке) в большей степени способствуют снижению флуоресценции хлорофилла за счет экранирующего эффекта. Также на сопоставлении данных КР и фоновой флуоресценции можно предположить, что в фотосинтетической антенне Cl. aegagropila и Cladophora rivularis находится меньше лороксантина и больше лютеина, который хорошо рассеивает свет в отличие от своего предшественника и тем самым препятствует доступу энергии света к хлорофиллу ССК и РЦ [11, 13]. .

Таблица 2 Амплитуда основных полос спектра КРС каротиноидов в водоросляхCladophora glomerata, Cladophora rivularis и Cladophora aegagropila

Пик, см-1	Амплитуда полосы, отн.ед.
	Cl. aegagropila	±	Cl. glomerata	±	Cl.rivu- laris	±
960	115	5	998,07	40	705	26
1004	411	18	4046,10	165	1985	75
1155	1456	65	15359,62	629	7771	295
1186	453	20	4151,96	170	2422	92

1210	179	8	2048,09	83	1205	45
1521	2047	92	19334,50	792	11707	444

 

Согласно работе B.Robert, W.I. Gruszecki [2, 6, 22], полоса 960 см-1 связана с внеплоскостными с кручениями вокруг С-С связей также может быть обусловлена связью с белками (чем выше интенсивность этой полосы тем меньшее количество каротиноидов связано с белками и соответственно они в большей степени подвержены кручениям вокруг С – С связи [2]), у Cl. rivularis наблюдается наименьшее количество каротин- связанных белков (более интенсивная амплитуда полосы 960 см-1), одновременно с (самым увеличенным соотношением 1521/1160). Возможно, данный факт обусловлен тем, что у вида Cl. rivularis наблюдается часть каротиноидов, связанных с белками ФСА (каротины и ксантофиллы), могли мигрировать в мембраны и/или в люмен либо в строму хлоропласта. Также у вида Cl. rivularis отмечается уменьшение (в 1,6- 1,8 раза) вклада валентных колебаний метиловой группы в сравнении с двумя другими видами водорослей (Табл.2, Рисунок 4). Вероятно, уменьшение количества пигмента связанного с белком могло поспособствовать стабилизации колебаний метиловой группировки.

Итак, в ходе проведенного исследования установлено неравномерное распределение ФХ по клеткам водорослей, что связано с разной функциональной активностью фотосинтеза в клетке; наличие положительной корреляции между снижением флуоресценции хлорофилла и ростом упорядоченности структуры молекул каротиноидов.

Review

By methods of Raman spectroscopy and microfluorimetry has been investigated the algae cells of the kind Cladofora. It was found that into the cells has been observed the uneven distribution of chlorophyll molecules associated with the different functional activity of photosynthesis. It has been revealed a positive correlation between the decline of chlorophyll fluorescence and the increasing in the ordering of the molecular structure carotenoids. It is discussed the mechanism of the involvement of carotenoids in the regulation of chlorophyll fluorescence in the various areas of the algae cells.

 

Список литературы

1.     Golovko T.K. Photosynthetic pigments chemical structure, biological function and ecology / T.K. Golovko, W.I. Gruszecki, M.N.V. Prasad, [et al.] – Syktyvkar. –2014. – 448p.

2.     Robert B. The Electronic Structure, Stereochemistry and Resonance Raman Spectroscopy of Carotenoids// The Photochemistry of Carotenoids. – 2004. Kluwer Academic Publishers New York, Boston, Dordrecht, London, Moscow: P.189–201

3.     Merlin J.C. Resonance Raman spectroscopy of carotenoids and carotenoid-containg systems//Pure & Appl. Chem.– 1985. - Vol. 57. - №5. – P. 785-792.

4.     Ilioaia C. Origin of Absorption Changes Associated with Photoprotective Energy Dissipation in the Absence of Zeaxanthin/C. Ilioaia, M.P. Johnson, C.D.P. Duffy, [et al.]//The  journal  of  biological chemistry. – 2011. – Vol.286. – №1. – P.91–9

5.     Kłodawska K. EPR study of thylakoid membrane dynamics in mutants of the carotenoid biosynthesis pathway of Synechocystis sp. PCC6803/ K. Kłodawska, M. Przemysław, M. Kis, [et. al].//Acta biochimica polonica. – № 1. – Vol. 59. – 2012. – P.87–90

6.     Gruszecki W. I. Carotenoids in Membranes / Gruszecki W.I. //The photochemistry of carotenoides. – 2004. Kluwer Academic Publishers New York, Boston, Dordrecht, London, Moscow: P. 363-367

7.     Havaux M. Carotenoids as membrane stabilizers in chloroplasts / Havaux M. // Trends in plant science. Perspectives. – 1998 – Vol. 3 – No4

8.     Ёfer L.S. Functional in situ evaluation of photosynthesis-protecting carotenoids in mutants of the cyanobacterium Synechocystis PCC6803/ L.S. Ёfer, A. Vioque, G. Sandmann // Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. – 2005. – Vol.78. – P.195–201

9.     Gruszecki W.I. Carotenoids as modulators of lipid membrane physical properties / W. I. Gruszecki, K. Strzayka//Biochimica et Biophysica Acta. – 2005. – Vol.1740. – P.108– 115

10. Максимов Г.В. Исследование вязкости возбудимых мембран с помощью пектроскопии комбинационного рассеяния/ Г.В. Максимов, Ч.Н. Раденович, Ю.Е. Борисова, [и др.]// Биофизика.–1996. – Т.41. – С.400-406.

11. Yoshii Y. Carotenoid compositions of Cladophora balls (Aegagropila Linnaei) and some members of the Cladophorales (Ulvophyceae, Chlorophyta): their taxonomic and evolutionary implication/ Y. Yoshii, T. Hanyuda,I. Wakana, [et al.] //Phycological Society of America – 2004. – Vol.40. – P.1170–1177

12. Bodea S. On the regulation of photosynthesis by excitonic interactions between carotenoids and chlorophylls/S. Bodea, C.C. Quentmeiera, P.-N. Liaoa, [et al.]//PNAS. – 2009. – Vol.106 – Iss.30. – P.12311–12316

13. Jahns P. The role of the xanthophyll cycle and of lutein in photoprotection of photosystem II/P. Jahns, A.R. Holzwarth//Biochimica et Biophysica Acta. – 2012. – Vol.1817. – P.182–193

14. Koyama Y. Cis-Trans Carotenoids in Photosynthesis: Configurations, Excited-State Properties and Physiological Functions / Y. Koyama, R. Fujii //The Photochemistry of Carotenoids. – 2004 Kluwer Academic Publishers New York, Boston, Dordrecht, London, Moscow: P.161–188

15. Andreeva A. Temperature dependence of resonance Raman spectra of carotenoids / A. Andreeva, I. Apostolova,

M. Velitchkova // Spectrochimica Acta part A: Biomolecular Spectroscopy. – Vol.78. – 2011. – P.1261 – 1265

16. Telfer A. Too much light? How b-carotene protects the photosystem II reaction centre/A. Telfer//Photochemistry Photobiology Science. – 2005. – Vol.4. – P.950- 956

17. Jahns P. Mechanism and regulation of the violaxanthin cycle: The role of antenna proteins and membrane lipids /P. Jahns, D. Latowski, K. Strzalka // Biochimica et Biophysica Acta. – 2009. – 1787. – P. 3–14Takaichiemail S. Carotenoids in Al gae: Distributions, Biosyntheses and Functions / S. Takaichiemail // Mar. Drugs. – 2011.- Vol. 9, № 6. - P. 1101-1118.

18. Collins A.M. Carotenoid Distribution in Living Cells of Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae) A.M. Collins,H.D.T. Jones, D. Han3, [et al.]// PLOS ONE. – 2011. – Vol.6. – Iss.9. – P.123-134.

19. Соловченко А., Мерзляк М. Оптическое экранирование как фотозащитный механизм растений. М.: А- Литера. — А-Литера Москва, 2010. — С. 164.

20. Фотосинтез и флуоресценция: [Электронный ресурс] / А. Гордон. –М.; 2003.–Режим доступа: http://gordon0030.narod.ru/archive/12781/index.html

21. Gruszecki W.I. Light-induced Change of Configuration of the LHCII-Bound Xanthophyll (Tentatively Assigned to Violaxanthin): A Resonance Raman Study /W.I. Gruszecki, M. Gospodarek, W. Grudzinski, [et al.]//Journal Physical Chemistry B. – 2009. – Vol.113. – P.2506–2512