ОПРЕДЕЛЕНИЕ БАНКОЛА В КРОВИ

2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропан) (в дальнейшем банкол) (синонимы: рубан, бенсултап, виктенон) – биологически активное вещество, обладающее антихолинэстеразным действием и широко применяющееся в качестве инсектицида [2, 3].

Банкол представляет собой белые, иногда с кремоватым оттенком кристаллы, не имеющие запаха, плавящиеся при температуре 84-85оС способные разрушаться в условиях нагревания до 150 °С.

Рассматриваемое соединение при 20 оС плохо растворимо в воде (0,75 мг/л), лучше - в гексане (319 мг/л), хорошо растворимо в толуоле, метаноле и этилацетате (соответственно 83300, 10480 и 149000 мг/л). При 20 оС и нейтральной реакции среды водного слоя значение коэффициента распределения в системе октанол/вода составляет 2,29∙103 [4, 6].

Банкол обладает достаточной токсичностью по отношению к теплокровным животным и человеку. Например, LD50 для крыс при внутрижелудочном введении составляет приблизительно 1000 мг/кг [1, 3, 5].

Описаны  случаи отравления  людей банколом и рядом других серосодержащих  соединений на территории Российской Федерации и за рубежом, в том числе с летальным исходом [6-8].

 Широкое применение банкола, токсические свойства данного вещества, наличие отравлений с летальным исходом позволяют считать это соединение потенциальным объектом химико- токсикологического анализа. При этом до настоящего времени в химико-токсикологическом отношении банкол изучен недостаточно. Например, это касается вопросов определения банкола химическими методами в жидких биологических средах организма.

Целью настоящей работы явилось изучение особенностей идентификации и количественного определения банкола в крови.

Материалы и методы исследования

 Объектом исследования явился 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропан (банкол) (СОП 342-034-2003) с содержанием основного вещества не менее 97%.

Исследования проводили на модельных смесях анализируемого вещества с кровью, которые предварительно выдерживали 1,5 часа при комнатной температуре.

В качестве изолирующего агента для извлечения банкола из биологического материала рассмотрен этилацетат, Проводился поиск оптимальных условий изолирования банкола их крови данным изолирующим агентом.

Для очистки аналита, извлекаемого из биологической матрицы, использовалась адсорбционная колоночная хроматография. Использовалась колонка диаметором 11 мм, заполненная 10 г нормальнофазового сорбента. Эдюат собирали фракциями по 2 мл каждая.

Идентификацию и количественный анализ банкола в очищенных извлечениях осуществляли методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии.

При определении методом ТСХ использовали стандартные пластины «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ. Проявляли хроматограммы, облучая их УФ-светом с длиной волны 254 нм.

Определение методом УФ-спектрофотометрии проводили, используя спектрофотометр СФ-56 и кюветы с толщиной рабочего слоя 10 мм.

Результаты и их обсуждение

 Установлено, что оптимальные условия извлечения анализируемого соединения этилацетатом могут быть достигнуты уже при двукратном настаивании биологического объекта с изолирующим агентом при условии, что количество последнего в каждом случае должно превышать количество биоматериала по массе как минимум в 2 раза, а продолжительность каждого настаивания составлять не менее получаса.

Достаточная эффективность очистки аналита от эндогенных веществ биожидкости обеспечивается при хроматографировании в колонке силикагеля L 40/100 мкм при последовательном элюировании гексаном (20 мл) и системой растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (8:3:0,6). Анализируемое вещество обнаруживается в этом случае во фракциях № 11-14 (21- 28 мл).

Установлено, что поглощение банкола в среде 95% этанола характеризуется наличием выраженных полос поглощения с максимумами в области 210 нм и 255 нм (значения молярного коэффициента поглощения составляют соответственно 19660 и 6023).

Линейная зависимость оптической плотности фотометрируемого раствора в области длины волны 255 нм от содержания в растворе анализируемого вещества соблюдалась в интервале концентраций 2-80 мкг/мл.

Уравнение градуировочного графика, для определения количественного содержания банкола в извлечениях из крови описывалось уравнением прямой линии и имело вид: А = k∙С + b = 0,013871C+0,001098, где А – оптическая плотность; С – концентрация бануола в фотометрируемом растворе, мкг/мл.

Коэффициент корреляции составлял 0,9998.

 Разработанная схема исследования включала изолирование банкола из биологической матрицы, его очистку, идентификацию и количественное определение.

Изолирование. 25 г искусственной смеси рассматриваемого соединения с кровью или такое же количество контрольного образца биоматериала настаивали 30 минут с 50 г этилацетата при периодическом перемешивании. Извлечение отделяли путём фильтрования через бумажный фильтр. Настаивание повторяли в описанных условиях. Фильтр и остаток на фильтре промывали 20 г этилацетата. Фильтраты объединяли, фильтровали через безводный сульфат натрия (через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1 – 1,5 см), сульфат натрия промывали 20 г этилацетата. Фильтрат и промывную жидкость объединяли и упаривали в токе воздуха при комнатной температуре до сухого остатка.

Очистка. Остаток растворяли в 4 мл хлороформа, 2 мл полученного раствора смешивали с 1 г силикагеля L 40/100 мкм и испаряли остатки хлороформа из сорбента в токе воздуха.

В колонку размером 490×10 мм вносили вначале 9 г силикагеля типа L 40/100 мкм, а затем, поверх образующегося слоя, - 1 г силикагеля L 40/100 мкм, содержащего анализируемое вещество, предварительно введённое в виде хлороформного раствора. Через колонку вначале пропускали гексан, после истечения из колонки 20 мл элюата начинали элюировать системой растворителей гексан - диоксан – пропанол-2 (8:3:0,6 по объему). С момента начала подачи данной системы элюат собирали фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 11 по 14 включительно объединяли, элюент испаряли в токе воздуха при комнатной температуре. Остаток растворяли в 5 мл диоксана (исходный диоксановый раствор).

В выпарительную чашку № 1 вносили 0,2 мл «исходного диоксанового раствора» (при необходимости этот объём мог быть увеличен до 1,0 мл). В выпарительные чашки № 2 и № 3 вносили соответственно 2 мл и 1 мл «исходного диоксанового раствора». Порции раствора во всех чашках испаряли в токе воздуха при комнатной температуре до получения сухих остатков.

Идентификация. Остаток в чашке № 1 растворяли в незначительном количестве хлороформа и количественно переносили раствор в виде полосы на линию старта хроматографической пластины «Силуфол» UV-254. Процесс хроматографирования осуществляли, применяя элюент гексан-диоксан- пропанол-2 (8:4:0,8).

При определении методом ТСХ исследуемое вещество идентифицировали по совпадению его значения Rf на хроматограмме с таковым вещества-свидетеля, которое составляло в данном случае 0,41±0,03.

После предварительного хроматографирования методом ТСХ остатка из чашки № 1 участок хроматограммы с пятном анализируемого вещества вырезали из пластины, помещали в пробирку, элюировали вещество из сорбента 95% этанолом в течение 15 минут и исследовали поглощение элюата в интервале  длин волн 200-360 нм  на фоне  контрольного  раствора.  При необходимости анализируемый раствор разбавляли. Определяемое соединение идентифицировали по характерной форме спектральной кривой и положению максимумов поглощения.

Количественное определение. По величине оптической плотности этанольного элюата, измеренной при длине волны 255 нм, определяли количественное содержание вещества, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывали на определённую навеску биоматериала.

Результаты количественного определения рассматриваемого соединения в  крови методом УФ- спектрофотометрии представлены в таблице.

Таблица Результаты количественного определения банкола в крови на основе изолирования этилацетатом и очистки методом колоночной хроматографии (n=5, P=0,95)

Как свидетельствуют полученные данные, при содержании анализируемого вещества в количестве 2,5-50,0 мг в 25 г крови с помощью разработанной методики удаётся определить 75,49-77,03 % банкола с полушириной доверительного интервала 2,77-4,18 %. Определяемый минимум данной методики (в 100 г биологической жидкости) составляет 0,25 мг вещества.

Выводы

1.     В качестве изолирующего агента для извлечения банкола из крови рассмотрен этилацетат. Определены оптимальные условия изолирования банкола этилацетатом.

2.       Для очистки аналита от эндогенных соединений биологической матрицы применена адсорбционная хроматография в колонке силикагеля L 40/100 мкм.

3.   Предложены условия идентификации и количественного определения банкола в извлечениях из крови методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии. При количественном определении полуширина доверительного интервала колеблется в интервале 2,77-4,18 % если содержание аналита в 25 г крови составляет 2,5-50,0 мг.

Список литературы

1.        Баранов Ю.Н., Шорманов В.К., Терских А.П. Изучение сохраняемости 2-диметиламино-1,3-бис- (фенилсульфонилтио)пропана в биологическом материале // Проблемы медицины в современных условиях: сборник научных трудов по итогам международной научно-практической конференции (Казань, 10 июня 2014 г.). – Казань: Инновационный центр развития образования и науки; ГБОУ ВПО Казанский государственный медицинский университет, 2014. – С. 353-356.

2.      Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации, 2012 год. Министерство сельского хозяйства Российской Федерации.-М., 2012.-575 с.

3.      Григорьев, А.М. Идентификация и определение производных и продуктов метаболизма банкола и методами ГЖХ-МС и ВЭЖХ для целей судебно-химического и химико-токсикологического анализа / А.М. Григорьев, А.А. Мельник, Л.В. Рудакова // Сорбционные и хроматографические процессы.- 2008.-Т. 8, вып. 5.-С. 766-778.

4. Мельников, Н.Н. Пестициды и регуляторы роста растений: справочник / Н.Н. Мельников, К. В. Новожилов, С. Р. Белан. – М.: Химия, 1995. – 575 с.

5.    Определение бенсултапа в биологическом материале растительного происхождения / В.К. Шорманов, Ю.Н. Баранов, А.П. Терских и др. // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». – 2014. – № 3. – С. 94-101.

 6.    Особенности распределения банкола в организме теплокровных животных / Шорманов В.К., Белых Е.А., Баранов Ю.Н., Терских А.П. // Судебно-медицинская экспертиза. – 2013. – Т. 56, № 5. – С. 34- 37.

7.      Шорманов В.К., Галушкин С.Г., Терских А.П. Распределение карбосульфана в организме теплокровных животных // Судебно-медицинская экспертиза. – 2015. – Т. 58, № 5. – С. 23-29.

8.      Шорманов В.К., Галушкин С.Г., Терских А.П. Изолирование диметоата из растительных биологических объектов // Проблемы медицины в современных условиях: сборник научных трудов по итогам международной научно-практической конференции (Казань, 10 июня 2014 г.). – Казань: Инновационный центр развития образования и науки; ГБОУ ВПО Казанский государственный медицинский университет, 2014. – С. 351-353.