ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ ОКИСЛЕНИЯ АДРЕНАЛИНА В РАЗЛИЧНЫХ СРЕДАХ СПЕКТРАЛЬНЫМ МЕТОДОМ

Введение

Организм человека способен подвергаться значительному окислительному стрессу в результате нарушения равновесия между антиоксидантными защитными системами и сильными окислителями, в том числе свободными радикалами. Нарушение про/антиоксидантного баланса способно повредить ДНК, белки, липиды, углеводы и оказывает отрицательное воздействие на внутриклеточную передачу сигнала. Существенная антиоксидантная активность признана для соединений групп витаминов А, С, Е; актуальными антиоксидантами являются препараты альфа-липоевой кислоты, мельдония; цитиколина; левокарнитина; коэнзима Q10, янтарной кислоты; экстракта гинкго билоба и т.д.. Важное место в этой группе занимают фенольные структуры, в частности кверцетин и другие катехины. Обнаружено, что катехоламины допамин, адреналин и норадреналин гораздо сильнее и эффективнее проявляют себя в роли ингибиторов окисления, чем токоферол, в частности, при окислении фосфолипидов [6]. Исходя из понимания двойственности процессов окисления и восстановления, разрушения и стабилизации легкоокисляющийся адреналин, даже в минимальных количествах, может являться пусковым механизмом ряда важных процессов, защитой от окислительного стресса. Использование в качестве одной из общепринятых моделей определения оксидантной активности модели адреналина требует изучения условий и механизма течения данного процесса. Поэтому представляется важным изучить условия окидантной активности молекулярного адреналина в сопоставлении с его наиболее распространенными в Российской Федерации препаратами.

Говоря о препаратах адреналина нельзя не учитывать компонентный состав лекарственной формы, участие антиоксидантов в составе препаратов для поддержания восстановленной формы самого адреналина в равновесии. Очевидно, что все эти процессы определяют особенности его биологической активности.

Поэтому, целью данного исследования является изучение возможности использования фармацевтических препаратов адреналина в качестве модели для изучения оксидантной активности исследуемых веществ.

Материалы и методы

Спектральные исследования окисления адреналина проводили в 0,2М бикарбонатном буфере в соответствии с методикой [3]. Буфер готовили из Na2CO3 (ХЧ, «Компонент реактив», Россия) и NaHCO3 (ХЧ, «Компонент реактив», Россия), его кислотность на уровне 10,5 контролировали на рН – метре ИТАН (Томь Аналит, Россия). В работе использовали: 0,1% раствор адреналина гидротартрата («СОЛОфарм», ООО ГРОТЕКС, Россия) и («Московский эндокринный завод» (МЭЗ), Россия).

Измерения проводили при комнатной  температуре (20◦С) на спектрофотометре СФ-2000 (ОКБ «Спектр», Россия) в диапазоне длин волн 200-500 нм в режиме «Кинетика». Регистрацию реакции автоокисления адреналина начинали с момента внесения 0,23 мМ адреналина гидротартрата в буфер, который предварительно был перемешан (1000 об/мин 20 секунд) на приборе VibroFix VF1 Electronic. Образование продукта окисления фиксировали на характеристической длине волны 347 нм. Представленные данные являются средними значениями, полученными в независимых экспериментах при 5 параллельных измерениях в каждом опыте. Статистическую обработку результатов и построение графического материала проводили с использованием программы Microsoft Excel.

Результаты и их обсуждение

Препараты адреналина, предлагаемые аптечными сетями в основном производства ООО ГРОТЕКС ("СОЛОфарм"), Россия; ФГУП МЭЗ, Россия и Шаньдун Шэнлу Фармасыотикал Ко., Лтд, Китай. Производители обычно вводят «инертные» или стабилизирующие фармацевтические компоненты для поддержания качества продукта (стабильности основного компонента). Примерами таких веществ могут быть широко известные антиоксиданты: метабисульфит натрия, трилон Б и т.д. Например, исходя из официальной информации (табл.1), метабисульфит входит в состав препарата производства ФГУП МЭЗ и в лекарственную форму китайского производства (Шаньдун Шэнлу Фармасыотикал Ко., Лтд, Китай), причем, в китайском препарате его в 5 раз меньше, чем в препарате ФГУП МЭЗ, а в препарате "СОЛОфарм" производства ООО «ГРОТЕКС» он  вообще отсутствует. В таблице 1 приведены открытые данные по составу трех указанных выше препаратов.

Таблица 1.

Вспомогательные  вещества  в  фармацевтических  препаратах  адреналина  0,1%       различных производителей.

Сравнение оксидантных процессов адреналина проведено in vitro в препаратах производства компаний МЭЗ и СОЛОфарм методами аналитической и кинетической спектроскопии. Сопоставлены УФ- спектры поглощения, полученные экспериментально, в том числе представленные в авторитетных изданиях [1,5] и авторских работах [2,6]. Все работы демонстрируют принципиальное спектральное сходство чистого адреналина и аптечных препаратов адреналина производства МЭЗ и «СОЛОфарм» по базовым полосам в начальный момент времени. Батохромный сдвиг полос происходит при смещении рН в щелочную область, а так же в средах, не ограничивающих изменения кислотности (вода, раствор натрия хлорида).

В диапазоне 220 - 550 нм признаком окисления адреналина является формирование полосы поглощения с батохромным сдвигом. На спектре чистого адреналина в водной среде и физрастворе [6] по мере окисления в течение 20 минут появляется интенсивная полоса λmax 300 нм, возникает широкая полоса на λmax 480 нм. Интенсивность всех полос, особенно длинноволновой, прирастает во времени, что соответствует формированию новых внутри и межмолекулярных связей. Продуктом этого процесса считается адренохром (3-гидрокси-1-метил-2,3-дигидро-1H-индол-5,6-дион), оптические характеристики которого (EmM= 4.02 при 480) полностью соответствуют описанным выше спектрам.

Иная ситуация возникает при применении в качестве среды буфера: фосфатного [6] или карбонатного [4]. В нейтральной среде фосфатной буферной системы возникает уширение (батохромный сдвиг) основной полосы с формированием условного максимума на λmax 325 нм. Интенсивность этой полосы поглощения растет по мере окисления адреналина. В щелочной среде pH=10,5 карбонатного буфера происходит формирование широкой, но явной полосы с λmax 345 нм. В качестве продуктов окисления в данных условиях наиболее вероятны дегидроадреналин и адреналон.

Кинетические кривые поглощения в точках экстремума исследуемых препаратов адреналина МЭЗ и СОЛОфарм (рис 1.) показывают, что в меньшей степени изменения касаются наиболее коротковолновой полосы. Стабильно минимальные значения констант скорости не зависимо от выбранного расчета порядка реакции (рис. 2) говорят о том, что перестройка поглощающей на этих длинах волн структуры минимальна и идет независимо от внешних воздействий. На рис. 1 приведены кинетические кривые окисления адреналина. Их сравнение показывает, что спектры адреналина двух разных фирм совпадают.

Продукт реакции поглощает в области 345-347 нм и здесь интенсивность полосы нарастает в два этапа: сначала интенсивно, затем более медленно. Если в препарате добавлен метабисульфит натрия (МБС), то наблюдается отсроченный период окисления - «лаг» период (рис.1, Б). Для полосы продукта реакции в принятом размахе Dk наиболее линейны графики кинетических уравнений 0-го и 3-го порядков (рис. 2), что подтверждает самопроизвольность и стадийность процесса и говорит об участии даже трёх компонентов на отдельных этапах реакции.

Как видно, единственным различием между указанными препаратами ООО ГРОТЕКС и МЭЗ является наличие метабисульфита натрия. МБС, являясь признанным антиоксидантом фармацевтической и пищевой промышленности, удерживает исследуемый нами процесс окисления препаратов адреналина не более 10 минут. В дальнейшем и скорость окисления и количество продукта окисления адреналина сравнивается с таковым в нестабилизированном препарате. Следовательно МБС не является эффективным антиоксидантом для адреналина, а в большей степени маскирует спектральные проявления его окисления.

Выводы

1)        Адреналинсодержащие препараты МЭЗ и СОЛОфарм возможно использовать в качестве моделей определения оксидантной активности.

2)        Структурные изменения спектров адреналина при его окислении затрагивают периферическую часть его молекулы.

3)        Кинетика окисления препаратов адреналин МЭЗ и СОЛОфарм сходна с 45 минуты процесса.

4)        Чередование порядков реакции для изученных объектов опыта сходно, что говорит о сходстве механизмов окисления.

Список литературы

1.        Государственная фармакопея Российской Федерации, 14 изд., Эпинефрина гидротартрат (ФС 2.1.0217.18)

2.        Зориков П.С., Колдаев В.М. Спектрофотометрические параметры некоторых алкалоидов // Тихоокеанский медицинский журнал.- 2013.- № 2.- С. 28-30

3.        Патент № 2144674 Российская Федерация, МПК G01N33/52 (2000.1) , МПК G01N33/68 (2000.1). Способ определения антиоксидантной активности химических соединений : № 99103192/14 : заявл. 24.02.1999 : опубл. 20.01.2000 / Сирота Т.В. ; заявитель Сирота Т.В..- 3 с.

4.        Сирота Т.В. Стандартизация и регуляция скорости супероксидгенерирующей реакции автоокисления адреналина, используемой для определения про/антиоксидантных свойств различных материалов // Биомедицинская химия.- 2016.- Т. 62, № 6.- С. 650-655.

5.        Clarke's Analysis of Drugs and Poisons, Part four: Indexes to analytical data London, UK, Pharmaceutical Press, 2004. – 1935 рр.

6.        Kancheva V.D., Kasaikina O.T. Lipid oxidation in homogeneous and micro-heterogeneous media in          presence          of          prooxidants,          antioxidants         and          surfactants.          URL: http://www.intechopen.com/booksprocess/action/chapter/74487 (дата обращения: 20.11.2019)