29 марта 2016г.
В последнее время большое внимание уделяется изучению оксида азота, как внутриклеточного мессенджера. Многие исследования с использованием фармакологических и биохимических инструментов показали, что NO влияет на гормональный ответ и запрограммированную гибель клеток, а также обладает регуляторными функциями [7]. Оксид азота проявляет противовоспалительное и антиопухолевое действие [2]. Все вышеперечисленное позволяет рекомендовать использовать оксид азота в терапевтической практике. Однако многие аспекты механизма действия оксида азота до конца не изучены, а имеющиеся в литературе сведения противоречивы.
Целью работы явилось исследование влияния газообразного NO на динамику перекисного окисления липидов и содержание субстратов энергетического метаболизма в крови здоровых животных.
Материалы и методы исследования
Эксперимент проведен на 16 белых крысах-самцах линии Wistar массой 200-250 г. Все животные содержались в стандартных условиях вивария в клетках при свободном доступе к пище и воде на рационе питания, соответствующем нормативам ГОСТа «Содержание экспериментальных животных в питомниках НИИ» (1978 год). Животных разделили на 2 группы: контрольную (интактные здоровые животные, n=8) и опытную (интактные животные с ингаляциями NO, n=8). Ингаляции NO проводили по 5 минут (20 ppm) ежедневно в течение 10 дней от генератора оксида азота (РФЯЦ, г.Саров). Животных выводили из эксперимента путем декапитации под наркозом (золетил + зсила). Для исследований биохимических показателей использовали плазму и эритроциты крови.
Активность процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ) изучали с помощью метода индуцированной биохемилюминесценции на БХЛ-06 (Н. Новгород). Оценивали следующие параметры хемилюминограммы: tg 2α –характеризует скорость спада ПОЛ в плазме и свидетельствует об антиоксидантной активности; S – светосумма хемилюминесценции за 30 сек. отражает потенциальную способность биологического объекта к ПОЛ. Содержание малонового диальдегида (МДА) оценивали по М. Mihara, М. Uchiyama [6]. Для определения активности каталазы использовали спектрофотометрический метод [3]. Активность СОД рассчитывали по ингибированию образования продукта аутокисления адреналина [4].
Активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в прямой реакции (ЛДГпр) и обратной реакции (ЛДГобр) определяли по Г.А. Кочетову [1]. Для выявления нарушений энергетического метаболизма в органах крыс рассчитывали соотношение ЛДГобр/ЛДГпр [5]. Для оценки субстратов энергетического метаболизма исследовали концентрацию глюкозы и лактата в плазме и эритроцитах на приборе марки Super GL ambulance.
Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statistica 6,0. Достоверность различий между группами оценивали с использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты и их обсуждение
Показано, что воздействие оксида азота на интактных животных способствовало повышению активности антиоксидантных ферментов: СОД статистически значимо увеличилась на 57%, каталазы – на 40%. При этом отмечено снижение общей антиоксидантной активности на 57% после курса ингаляций NO (Табл.1).
Исследование концентрации вторичного продукта ПОЛ, малонового диальдегида, показало, что после курса ингаляций NO здоровых животных содержание МДА в плазме крови крыс статистически значимо снизилось на 30%. При этом отмечена тенденция к росту уровня МДА в эритроцитах под воздействием NO (Рисунок 1).
Таблица 1
ПОЛ и антиоксидантная активность крови после ингаляций NO
|
Условия
эксперимента
|
S в плазме,
усл. ед.
|
tg 2α,
усл. ед.
|
S в эритроцитах,
усл. ед.
|
СОД,
усл.ед./мг белка
|
Каталаза,
усл. ед./мг белка
|
|
Интактные крысы
|
11,41
|
0,760
|
9,06
|
482,35
|
19,04
|
|
|
±0,44
|
±0,04
|
±0,48
|
±48,41
|
±2,85
|
|
Ингаляции NO
|
12,58
±0,79
|
0,330
±0,042*
|
9,34
±0,15
|
756,12
±30,05*
|
27,19
±2,07*
|
Примечание здесь и в последующих таблицах и рисунках: * - различия статистически значимы по сравнению с интактными крысами (p<0,05).
Исследование активности ЛДГ под влиянием NO не выявило статистически значимых изменений каталитических свойств фермента (Табл.2). При этом отмечено уменьшение соотношения ЛДГобр/ЛДГпр после курса ингаляций, что указывает на снижение количества молочной кислоты, вследствие чего можно предположить, что ингаляции монооксидом азота проявляют защитное действие, направленное против лактатацидоза.
При этом уровень лактата в крови интактных крыс после ингаляций не имел статистически значимых отклонений от показателя здоровых животных (Рисунок 2).
Таблица 2
Активность лактатдегидрогеназы после ингаляций NO
|
Условия эксперимента
|
ЛДГпр,
нмоль НАДН/мин × мг белка
|
ЛДГобр,
нмоль НАДН/мин
×
мг белка
|
ЛДГобр/ЛДГпр
|
|
Интактные крысы
|
73,40±4,28
|
91,90±9,78
|
1,25±0,06
|
|
Ингаляции NO
|
92,87±12,13
|
103,62±8,17
|
1,11±0,02*
|
Показано, что при ингаляциях NO концентрация глюкозы статистически достоверно возросла в плазме в 2,5 раза, в эритроцитах – в 2 раза (Рисунок 3), что указывает на интенсификацию процессов метаболизма, способствуя повышению активности и поддержанию
работы энергетических систем, и объясняется поступлением экзогенного NO (Малахов, 2009).
На основании полученных данных, можно сделать вывод о том, что ингаляции NO на здоровый организм индуцируют работу антиоксидантных ферментов и, как следствие, антиоксидантной системы, а также поддерживают работу клеток крови и ее энергетических систем.
Список литературы
1. Кочетов Г. А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высшая школа, 1980. 272 с.
2. Малахов В.О., Завгородня Г.М., Личко В.С. и др. Проблема оксида азота в неврологии: Монография. Суми: Издательство СумДПУ им. А.С. Макаренко, 2009. 242с.
3.
Сибгатуллина Г.В., Хаертдинова Л.Р., Гумерова Е.А., и др. Методы определения редокс-статуса культивируемых клеток растений: учебно-методическое пособие. Казань: Казанский Федеральный университет, 2011.61 с.
4.
Сирота Т.В. Новый подход в исследовании процесса аутоокисления адреналина и использование его для измерения активности супероксиддисмутазы // Вопросы медицинской химии. 1999. Т 45, № 3. С.109-116.
5.
Соловьева А.Г., Зимин Ю.В. Новый способ оценки динамики метаболизма крови у больных с термической травмой // Современные технологии в медицине. 2012. №2. С. 116-117.
6. Mihara M., Uchiyama M., Fukuzawa K. Biochemistry. N.Y.: Med., 1980. P.271.
7. Nigel M. New insights into nitric oxide metabolism and regulatory functions// Journal of biological chemistry.2005. Т.4., №10. P.195-200.
