Золпидем является представителем снотворных лекарственных средств третьего поколения, применяется в медицинской практике для лечения инсомний. Препарат обладает токсичностью. Описаны случаи интоксикаций золпидемом, в том числе со смертельным исходом. Для установления факта отравления необходимо определение золпидема в биологических объектах. Методики химико-токсикологического анализа золпидема в настоящее время разработаны недостаточно. Поэтому целью настоящей работы является определение золпидема в трупной ткани печени, а также установление предела определения и линейности.

Для выполнения поставленной цели мы использовали методику, разработанную ранее Карташовым В.А. с соавт. [1].

По 5,0 г тщательно измельченной ткани печени помещали в шесть пенициллиновых флаконов вместимостью 20 мл, в пять из которых добавляли по 1 мл водного раствора золпидема тартрата, содержащего 200 мкг в 1 мл, в шестой флакон помещали 1 мл воды. Содержимое флаконов перемешивали на аппарате для встряхивания в течение 2-х часов. В каждый флакон добавляли по 10,0 мл ацетона, экстрагировали в течение 10 минут, центрифугировали 5 мин при 3000 об/мин (I ступень).  Экстракты отделяли и процедуру экстрагирования повторяли ещё раз с использованием 5,0 мл ацетона (II ступень). Ацетоновые экстракты, полученные на каждой ступени процеживали через небольшие ватные тампоны в сухие пенициллиновые флаконы и выпаривали при 40^о С на водяной бане под слабым током воздуха до полного удаления ацетона. Содержимое флаконов смешивали с 5,0 мл 0,1 н. раствора соляной кислоты (рН 2), добавляли 5 мл н-гексана и экстрагировали в течение 5 мин. Органическую фазу отделяли центрифугированием и не исследовали, а водную - подщелачивали 25 % раствором гидроксида аммония до рН 9 и экстрагировали 5 мл хлороформа в течение 5 мин. Хлороформные экстракты отделяли, и экстракцию хлороформом повторяли еще один раз. Объединенные экстракты фильтровали через сухой бумажный фильтр в присутствии безводного сульфата натрия и выпаривали досуха при 40°С под слабым током воздуха. Сухие остатки с помощью нескольких капель хлороформа количественно наносили на стартовую линию пластины «Sorbfil» 100·150 см с флюоресцирующей добавкой в виде полосы, с одной стороны которой наносили смесь метчиков, с другой – стандартный раствор золпидема. Хроматографирование проводили в системе ацетон без предварительного насыщения камеры парами растворителя. Полученные хроматограммы обрабатывали реактивом Драгендорфа, зону окрашенную в оранжевый цвет, расположенную в V хроматогрофической группе на уровне стандарта (Рисунок 1), счищали в пенициллиновые флаконы.

Рис.1. Хроматограмма, полученная при исследовании     золпидема: 1 - точка нанесения смеси метчиков; 1^/  - точка нанесения стандарта , 2 и 2^/- стартовая и обнаруженная полосы золпидема соответственно.

 

Во флаконы добавляли по 5,0 мл 0,1 н. раствора щелочи и 5 мл хлороформа и экстрагировали в течение 5 мин и полученную смесь центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин.  Хлороформные экстракты отделяли, фильтровали через сухой бумажный фильтр в присутствии безводного сульфата натрия и выпаривали досуха при 40^о С на водяной бане под слабым током воздуха. Сухие остатки растворяли в 10 мл спирта и спектрофотометрирова

ли в диапазоне 200-400 нм по сравнению с раствором, полученным при исследовании холостой пробы, измеряя величины оптических плотностей в  максимуме поглощения спиртового раствора основания золпидема (при 243 нм). Данные спектрофотометрического анализа приведены на Рисунке 2, и в Табл.1.

Рис.2. Спектр абсорбции золпидема, выделенного из ткани печени (n=5): I, II –ступени экстракции.

 

Таблица 1

Выход золпидема при экстрагировании из ткани печени (n=5), λ_max = 243 нм.

Номера опытов	1 ступень		2 ступень		Сумма по ступеням		В пересчете на основание٭
	Значение D	Выход (%)	Значение D	Выход (%)	Значение D	Выход (%)	Выход (%)
1.	0,772	41,49	0,382	20,50	1,154	61,99	76,87
2.	0,758	40,72	0,375	20,13	1,133	60,85	75,45
3.	0,852	45,78	0,385	20,69	1,237	66,47	82,43
4.	0,695	37,34	0,362	19,43	1,057	56,77	70,39
5.	0,704	37,85	0,417	22,43	1,121	60,28	74,75
	0,756±0,06	40,64±3,22	0,384±0,02	20,64±1,06	1,140±0,06	61,28±3,33	75,98±4,14

٭Примечание: Молекулярная масса золпидема тартрата – 764,88, основания – 616,88.

 

Как видно из полученных данных (Рисунок 2.,Табл.1), золпидем экстрагируется из ткани печени за две ступени и определяется УФ-спектрофотометрическим методом в среднем в количестве 76%.

Установление предела обнаружения и линейности золпидема при экстрагировании его из ткани печени

Для установления минимального количества золпидема, которое может быть выделено из ткани трупной печени по вышеизложенной методике и определения линейности, были выполнены следующие эксперименты.

Экстрагирование золпидема из 5,0 г измельченной ткани печени, содержащей 200, 100, 50, 25, 10, 5, и 2,5 мкг золпидема тартрата, проводили, как выше описано, выполняя по 5 параллельных определений и одному холостому для каждой концентрации. Результаты приведены в Табл.3, и на Рисунке 3, которые показывают, что предел определения  золпидема по  приведенной методике составляет 5 мкг в 5 г печени. При этом линейность золпидема лежит в пределах 5 – 100 мкг (Рисунок 4).

Таблица 3

Данные по экстрагированию из ткани печени разных количеств золпидема (n=5)

Количество золпидема в 5 г печени (мкг)	Dср	Выход золпидема (%)
100	1,225	76,25	76,25±5,03
50	0,611	76,08	76,08±4,71
25	0,306	76,14	76,14±3,55
10	0,123	76,59	76,59±6,02
5	0,062	76,24	76,24±9,70

 

Рис.4. График зависимости величины оптической плотности от концентрации золпидема

 

Таким образом при использовании методики, основанной на применении ацетона в качестве экстрагента, вариантов экстракционной и хроматографической очистки, золпидем определяется в достаточно больших количествах независимо от его содержания в образцах. Установленный предел определения золпидема при экстрагировании из ткани печени свидетельствует о высокой чувствительности описанной методики.

 

Список литературы

1.     Карташов В.А., Чернова Л.В. Химико-токсикологический анализ. Ч. 1: Выделение токсических веществ из биологических объектов. Майкоп: Качество, 2008. 188 с.