В последнее время  большое внимание уделяется изучению оксида  азота, как  внутриклеточного мессенджера. Многие исследования с использованием фармакологических и биохимических инструментов показали, что  NO влияет на гормональный ответ и запрограммированную гибель клеток, а также обладает регуляторными функциями [7]. Оксид азота проявляет противовоспалительное и антиопухолевое действие [2]. Все вышеперечисленное позволяет рекомендовать использовать оксид азота в терапевтической практике. Однако многие аспекты механизма действия оксида азота до конца не изучены, а имеющиеся в литературе сведения противоречивы.

Целью работы явилось исследование влияния газообразного NO на динамику перекисного окисления липидов и содержание субстратов энергетического метаболизма в крови здоровых животных.

Материалы и методы исследования

Эксперимент проведен на 16 белых крысах-самцах линии Wistar массой 200-250 г. Все животные содержались в стандартных условиях вивария в клетках при свободном доступе к пище и воде на рационе питания, соответствующем нормативам ГОСТа «Содержание экспериментальных животных в питомниках НИИ» (1978 год). Животных разделили на 2 группы: контрольную (интактные здоровые животные, n=8) и опытную (интактные животные с ингаляциями NO, n=8). Ингаляции NO проводили по 5 минут (20 ppm) ежедневно в течение 10 дней от генератора оксида азота (РФЯЦ, г.Саров). Животных выводили из эксперимента путем декапитации под наркозом (золетил + зсила). Для исследований биохимических показателей использовали плазму и эритроциты крови.

Активность процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ) изучали с помощью метода индуцированной биохемилюминесценции на БХЛ-06 (Н. Новгород). Оценивали следующие параметры хемилюминограммы: tg 2α –характеризует скорость спада ПОЛ в плазме и свидетельствует об антиоксидантной активности; S – светосумма хемилюминесценции за 30 сек. отражает потенциальную способность биологического объекта к ПОЛ. Содержание малонового диальдегида (МДА) оценивали по М. Mihara, М. Uchiyama [6]. Для определения активности каталазы использовали спектрофотометрический метод [3]. Активность СОД рассчитывали по ингибированию образования продукта аутокисления адреналина [4].

Активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в прямой реакции (ЛДГпр) и обратной реакции (ЛДГобр) определяли по Г.А. Кочетову [1]. Для выявления нарушений  энергетического метаболизма в органах  крыс рассчитывали соотношение ЛДГобр/ЛДГпр [5]. Для оценки субстратов энергетического метаболизма исследовали концентрацию глюкозы и лактата в плазме и эритроцитах на приборе марки Super GL ambulance.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statistica 6,0. Достоверность различий между группами оценивали с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Показано, что воздействие оксида азота на интактных животных способствовало повышению активности антиоксидантных ферментов: СОД статистически значимо увеличилась на 57%, каталазы – на 40%. При этом отмечено снижение общей антиоксидантной активности на 57% после курса ингаляций NO (Табл.1).

Исследование концентрации вторичного продукта ПОЛ, малонового диальдегида, показало, что после курса ингаляций NO здоровых животных содержание МДА в плазме крови крыс статистически значимо снизилось на 30%. При этом отмечена тенденция к росту уровня МДА в эритроцитах под воздействием NO (Рисунок 1).

Таблица 1  

ПОЛ и антиоксидантная активность крови после ингаляций NO

Условия эксперимента	S в плазме, усл. ед.	tg 2α, усл. ед.	S в эритроцитах, усл. ед.	СОД, усл.ед./мг белка	Каталаза, усл. ед./мг белка
Интактные крысы	11,41	0,760	9,06	482,35	19,04

	±0,44	±0,04	±0,48	±48,41	±2,85
Ингаляции NO	12,58 ±0,79	0,330 ±0,042*	9,34 ±0,15	756,12 ±30,05*	27,19 ±2,07*

Примечание здесь и в последующих таблицах и рисунках: * - различия статистически значимы по сравнению с интактными крысами (p<0,05).

Исследование активности ЛДГ под влиянием NO не выявило статистически значимых изменений каталитических свойств фермента (Табл.2). При этом отмечено уменьшение соотношения ЛДГобр/ЛДГпр после курса ингаляций, что указывает на снижение количества молочной кислоты, вследствие чего можно предположить, что ингаляции монооксидом азота проявляют защитное действие, направленное против лактатацидоза.

При этом уровень лактата в крови интактных крыс после ингаляций не имел статистически значимых отклонений от показателя здоровых животных (Рисунок 2).

Таблица 2

 Активность лактатдегидрогеназы после ингаляций NO

Условия эксперимента	ЛДГпр, нмоль НАДН/мин × мг белка	ЛДГобр, нмоль НАДН/мин × мг белка	ЛДГобр/ЛДГпр
Интактные крысы	73,40±4,28	91,90±9,78	1,25±0,06
Ингаляции NO	92,87±12,13	103,62±8,17	1,11±0,02*

Показано, что при ингаляциях NO концентрация глюкозы статистически достоверно возросла в плазме в 2,5 раза, в эритроцитах – в 2 раза (Рисунок 3), что указывает на интенсификацию процессов метаболизма, способствуя  повышению  активности  и  поддержанию  работы  энергетических  систем,  и  объясняется поступлением экзогенного NO (Малахов, 2009).

На основании полученных данных, можно сделать вывод о том, что ингаляции NO на здоровый организм индуцируют работу антиоксидантных ферментов и, как следствие, антиоксидантной системы, а также поддерживают работу клеток крови и ее энергетических систем.

 

Список литературы

1.     Кочетов Г. А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высшая школа, 1980. 272 с.

2.     Малахов В.О., Завгородня Г.М., Личко В.С. и др.  Проблема оксида азота в неврологии: Монография. Суми: Издательство СумДПУ им. А.С. Макаренко, 2009. 242с.

3.     Сибгатуллина Г.В., Хаертдинова Л.Р., Гумерова Е.А., и др. Методы определения редокс-статуса культивируемых клеток растений: учебно-методическое пособие. Казань: Казанский Федеральный университет, 2011.61 с.

4.     Сирота Т.В. Новый подход в исследовании процесса аутоокисления адреналина и использование его для измерения активности супероксиддисмутазы // Вопросы медицинской химии. 1999. Т 45, № 3. С.109-116.

5.     Соловьева А.Г., Зимин Ю.В. Новый способ оценки динамики метаболизма крови у больных с термической травмой // Современные технологии в медицине. 2012. №2. С. 116-117.

6.     Mihara M., Uchiyama M., Fukuzawa K. Biochemistry. N.Y.: Med., 1980. P.271.

7.     Nigel M. New insights into nitric oxide metabolism and regulatory functions// Journal of biological chemistry.2005. Т.4., №10. P.195-200.