28 марта 2016г.
Создание и применение фармацевтических препаратов растительного происхождение наряду с препаратами, получаемыми путем химической технологии органического синтеза – актуальное направления современной медицины. Потребность в данном классе препаратов обусловлена тем фактом, что фитопрепаратам свойственны мягкость терапевтического действия и отсутствие выраженных побочных эффектов, а так же их действие в организме является комплексным. Такие препараты широко применяются в мировой медицинской практике для профилактики и эффективного лечения различного рода заболеваний [3]. В настоящее время исследования по поиску новых лекарственных средств направлены на изучение, получение и внедрение в производство экстрактов растений, действующими веществами которых обычно является целый ряд биологически активных веществ. Именно компонентный состав данных субстанций обуславливает их фармакологическое действие и физико-химические свойства.
Еще одним весомым аргументом, дающим обоснование актуальности данного вопроса, является стратегия фармацевтического рынка Российской Федерации, ориентированная на импортозамещение лекарственных средств, в том числе препаратов растительного происхождения.
Перспективным объектом в этом отношении представляется многолетнее травянистое растение семейства губоцветных зюзник европейский. Трава зюзника европейского является сырьем для получения экстракта, обладающего тиреотропной активностью, что было доказано в результате проведенных исследований [1, 2]. По данным фитохимического изучения в составе зюзника европейского травы обнаружены такие вещества как: кофейная кислота, этиловый эфир кофейной кислоты, протокатеховый альдегид; 5, 3, 4 – тригидрокси - 6, 7 – диметоксифлавон, апигенин, розмариновая кислота, метиловый эфир розмариновой кислоты, лютеолин, мезоинозит, метиловый эфир лютеолин – 7 – глюкуронида, этиловый эфир– 7 – глюкуронида, этиловый эфир апигенина и глюкоза [4,5].
Неотъемлемой частью создания препарата является разработка методик, позволяющих контролировать его качество. В этой связи целью нашего исследования явилась разработка и валидация методики количественного определения суммы фенольных соединений в данном сырье.
Объектом исследования служило сырье зюзника европейского, заготовленное в 2014 году в Ростовской области. При разработке методики количественного определения суммы фенольных соединений (с.ф.с.) был изучен спектр поглощения спирто-водного извлечения из травы зюзника. Согласно полученным данным в диапазоне длин волн от 300 до 400 нм исследуемое извлечение имеет максимум поглощения при длине волны 327±2 нм. Аналогичный максимум поглощения имеет раствор стандартного образца (СО) розмариновой кислоты (Рисунок 1). Полученный результат позволяет проводить количественное определение суммы фенольных соединений в траве зюзника в пересчете на розмариновую кислоту.
В ходе исследования были подобраны оптимальные условия для проведения экстрагирования и количественного определения фенольных соединений в траве исследуемого растения. Установлено, что максимальный выход изучаемой группы биологически активных веществ достигается при температурном режиме 60°С, где экстрагентом является спирт этиловый 40%-ный. На основании данных, полученных при проведении скрининга (Табл.1-3), экстрагирование из 1 г сырья целесообразно проводить 100 мл спирта при измельчении сырья не более 0,5 мм в течение 1 часа.
Таблица 1 Выход суммы фенольных соединений в зависимости от соотношения сырье: экстрагент. (Условия экстракции: T
= 60°С, t = 40 мин, Степень изм. ≤ 1 мм.)
|
Вариант
|
mсырья/Vэкстрагент, г/мл
|
Выход с.ф.с.,%
|
|
1
|
1/50
|
7,15±0,18
|
|
2
|
1/100
|
7,20± 0,13
|
|
3
|
1/150
|
7,21± 0,15
|
|
4
|
1/200
|
7,53± 0,12
|
Таблица 2 Выход суммы фенольных соединений в
зависимости от степени измельчения сырья. (Условия
экстракции: T = 60°С, t = 40 мин, Vэкстрагента = 100 мл.)
|
Вариант
|
Степень измельчения, мм
|
Выход с.ф.с.,%
|
|
1
|
≤
0,5
|
7,81± 0,15
|
|
2
|
≤
1
|
7,26± 0,19
|
|
3
|
≤
2
|
7,16± 0,11
|
|
4
|
≤
3
|
5,19±0,07
|
Таблица 3
Выход суммы фенольных соединений в зависимости от времени экстракции. (Условия экстракции: T = 60°С, Vэкстрагента = 100 мл, Степень изм. ≤ 0,5 мм.)
|
Вариант
|
Время, мин
|
Выход с.ф.с., %
|
|
1
|
30
|
6,72± 0,13
|
|
2
|
60
|
7,86± 0,14
|
|
3
|
120
|
7,90±0,13
|
|
4
|
180
|
7,96± 0,09
|
|
5
|
240
|
7,91±0,11
|
Описанные выше условия позволили разработать методику количественного определения суммы фенольных соединений.
Валидация разработанной методики проведена по следующим показателям: специфичность, линейность, правильность, внутрилабораторная прецизионность: сходимость и воспроизводимость методики.
Специфичность методики характеризуется совпадением максимумов поглощения спиртового извлечения
из зюзника европейского
травы и раствора СО розмариновой кислоты при длине волны 327±2 нм.
Определение линейности проводилось на 7 уровнях концентраций СО розмариновой кислоты в диапазоне 2,3 – 10,5 мгк/мл (Рисунок 2). По результатам проведенных исследований установлено, что зависимость носит линейный характер, коэффициент корреляции (R 2) составил
0,999, что близко к
единице и соответствует критерию приемлемости (R 2 не ниже 0,995).
Контроль правильности методики проводился на
модельных смесях трех концентраций с
содержанием СО розмариновой кислоты 25, 50, 75% к ее исходной концентрации в спиртовом извлечении из сырья зюзника (Табл.4).
Таблица 4
Контроль правильности методики
|
№ п/п
|
Найдено, мг
|
Добавлено СО, мг
|
Ожидаемое значение, мг
|
Полученное значение, мг
|
Абсолютная
ошибка, мг
|
Выход с.ф.с., %
|
|
1.1
|
86,2
|
22,4
|
108,6
|
106,6
|
- 2,0
|
98,13
|
|
2.1
|
83,8
|
43,6
|
127,4
|
127,1
|
- 0,3
|
99,76
|
|
3.1
|
84,8
|
62,8
|
147,6
|
148,0
|
+ 0,4
|
100,30
|
|
1.2
|
94,2
|
22,6
|
116,8
|
114,5
|
- 2,3
|
98,04
|
|
2.2
|
92,3
|
45,2
|
137,5
|
135,6
|
- 1,9
|
98,64
|
|
3.2
|
91,8
|
70,7
|
162,5
|
162,6
|
+ 0,1
|
100,06
|
|
1.3
|
73,1
|
19,7
|
92,8
|
90,3
|
- 2,5
|
97,33
|
|
2.3
|
73,3
|
38,9
|
112,2
|
112,8
|
+ 0,6
|
100,53
|
|
3.3
|
77,7
|
56,0
|
133,7
|
131,3
|
- 2,4
|
98,21
|
|
Среднее значение выхода, %
|
99,00
|
В разработанной методике процент восстановления (выход) находится в пределах от 97,33% до 100,53% , что отвечает требованиям критерия приемлемости (от 95% до 105%).
Для установления сходимости провели шесть параллельных определений на основании результатов которых (Табл.5) вычислили величину стандартного отклонения (S=0,185), относительной вероятной погрешности отдельного измерения (±1,76%) и коэффициента вариации. Значение коэффициента вариации 2,41% (критерий приемлемости: не более 5%), что свидетельствует о прецизионности методики по сходимости.
Внутрилабораторную воспроизводимость определяли два аналитика на девяти повторностях образца сырья зюзника европейского травы каждый, приготовленных независимо друг от друга в течение трех дней (Табл.6).
В результате проведенных исследований установлено, что коэффициент вариации (7,21%) не превышает 10%, что позволяет считать внутрилабораторную воспроизводимость результатов методики приемлемой.
Таблица 5
Контроль сходимости методики
|
№ п/п
|
Выход суммы фенольных соединений., %
|
|
1
|
7,99
|
|
2
|
7,60
|
|
3
|
7,48
|
|
4
|
7,63
|
|
5
|
7,81
|
|
6
|
7,58
|
Таблица 6
Контроль внутрилабораторной воспроизводимости методики
|
Аналитик
|
День
|
Выход с.ф.с., %
|
|
Обр.1
|
Обр.2
|
Обр.3
|
|
1
|
1
|
8,16
|
7,57
|
8,02 |
|
|
2
|
7,45
|
7,89
|
7,50
|
|
3
|
6,83
|
7,05
|
6,90
|
|
2.
|
1
|
8,04
|
7,99
|
7,60
|
|
2
|
7,81
|
7,63
|
7,58
|
|
3
|
6,54
|
6,56
|
6,71
|
На
основании полученных результатов разработана методика количественного определения суммы фенольных соединений в пересчете на розмариновую кислоту в зюзника европейского траве, которая оценена положительно по параметрам: специфичность; линейность; правильность; сходимость; внутрилабораторная воспроизводимость. Данная методика может быть включена в проект нормативной документации на новый вид лекарственного сырья – зюзника европейского трава.
Список литературы
1.
Айвазова А.С. Изучение тиреотропных свойств зюзника европейского (Lýcopus europaéus L): автореф. дисс….канд. биол. наук: 14.00.25 / Айвазова Аревик Степановна.- Москва.-2008.
2. Айвазова, А.С. Изучение тиреотропных свойств травы зюзника европейского Lycopus europaeus L. /А.С. Айвазова, В.К. Колхир, Т.Е. Трумпеи др. // Вопросы биологической медицины
и фармацевтической химии.-2008. -№1. -С.34-37.
3. Муравьева, Д.А. Фармакогнозия / Д.А. Муравьева, И.А. Самылина, Г.П. Яковлев. – М.: Медицина, 2002. – 656 с.
4. Шелухина, Н.А. Изучение химического состава зюзника европейского (Lycopus europaeus L.) / Н.А. Шелухина, А.А. Савина, В.И. Шейченко и др. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. -2010. -№11. -С.7-11.
5. Шелухина Н.А., Изучение химического состава травы зюзника европейского (Lýcopus europaéus L.) / Н.А. Шелухина, А.А. Савина, В.И. Шейченко и др. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. -2011. -№3. -С.6-9.
