ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ СИСТЕМНОГО ВВЕДЕНИЯ АУТОЛОГИЧНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА ПРИ ДИЛАТАЦИОННОЙ КАРДИОМИОПАТИИ

Актуальность темы.

Использование традиционных методов лечения больных с хронической сердечной недостаточностью современными лекарственными препаратами носит временный клинический эффект. Идея регенеративной терапии с использованием стволовых клеток костного мозга, а также специфических факторов роста, стимулирующих выход стволовых клеток в периферический кровоток, уже стала реальностью [1,3,4]. Однако, использование клеточной терапии при хронической сердечной недостаточности (ХСН), являющейся самым распространенным осложнением у больных, перенесших инфаркт миокарда, а также кардиомиопатии, весьма недостаточен. Актуальными остаются и вопросы безопасности, способов введения и оценки оптимального состояния культуральных клеток.

Известно, что в условиях хронического стресса (длительной хронической патологии) аутологичные клетки костного мозга утрачивают свою биорегуляторную активность и становятся мало пригодными для клеточной терапии [7]. Поэтому, в дополнительную задачу нашей работы входило оценить морфо-функциональное состояние культуральных клеток костного мозга до и после прекультивирования на ультраструктурном уровне, как без, так и при добавлении в культуральную среду ряда фармакологических препаратов; фосфокреатинина «Неотон», фруктозо-1,6-дифосфата «FDP».

Учитывая, что в научной литературе мало клинических работ, посвященных данным вопросам, в Национальном научном медицинском центре г.Астаны в рамках длительного наблюдения изучалась эффективность системного повторного (каждые 3 месяца до 5ти раз) введения аутологичных мононуклеарных прекультивированных клеток костного мозга (МККМ), полученных у пациентов Дилатационной кардиомиопатией (ДКМП) с выраженной хронической сердечной недостаточностью (ХСН) (EF<40%). В качестве модели был использован дизайн открытого неконтролируемого клинического исследования («до-после»).

Материалы и методы

Обследовано 46 пациента (38 мужчин и 8 женщин) в возрасте от 27 до 65 лет, находившихся на стационарном лечении в кардиологическом отделение АО «Национальный научный медицинский центр» с ДКМП, ХСН ФК II-III (NYHA) фракцией выброса левого желудочка (EF<40%), На этапе отбора у всех больных было получено информированное согласие на участие в проекте, и выполнены следующие исследования: клинические, биохимические анализы крови, исследование на онкомаркеры (РЭА, NSE, CYFRA, CA72-4, PCA, α- фетопротеин), электрокардиография (ЭКГ), эхокардиография (ЭХОКГ), коронароангиография (КАГ) – для исключения атеросклеротического поражения коронарных сосудов.

После клинико-лабораторного обследования и отбора по критериям включения пациентам проведена аспирация костного мозга из гребня подвздошной кости в количестве 400 мл. Биотехнологическим методом выделена гемопоэтическая фракция стволовых клеток (ГСК) с последующим прекультивированием их в течение 72 часов. Трансплантация ГСК проводилась системно (внутривенно) в среднем в количестве до 140×106 клеток.

Для электронно-микроскопического исследования культуральные клетки фиксировали в 2,5% растворе глютаральдегида с постфиксацией в 1% растворе четырехокиси осмия, проводили по общепринятой методике и заключали в эпон. Полутонкие и ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме Leiсa. Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим, азуром 2 и основным фуксином [9]. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу и изучали в электронном микроскопе Libra-120 (C.Zeiss).

Трансплантацию МККМ провели путем внутривенного капельного введения в течение 60-90 минут в локтевую вену под контролем измерений артериального давления, частоты сердечных сокращений и термометрии. Повторное введение клеток проводилось через 3-6-9-12 месяцев. Все пациенты получали базовую терапию ХСН (ингибиторы АПФ, В-блокаторы, антагонисты альдостерона, мочегонные). Качество жизни больных с ХСН определяли по Миннессотскому опроснику (MLHFO).

Статистический анализ проводился с помощью программных пакетов STATISTICA 6.1 for Windows; IBM SPSS версии 18.0.

Результаты исследования.

Электронномикроскопически аутологичные клетки костного мозга, исследованные до культивирования, были представленны гетерогенной популяцией стволовых, прогениторных  и дифференцированных клеток  с выраженным полиморфизмом субмикроскопического строения и характерными особенностями ультраструктуры различных морфологических классов клеток костного мозга. Митохондрии в основном имели конденсированный тип строения - с электронноплотным матриксом  и частыми  кристами с электроннопрозрачными внутрикристными пространствами. По данным литературы конденсированные митохондрии характеризуются высоким уровнем макроэргических соединений и находятся в клетках с активными биоэнергетическими и биосинтетическими процессами [8]. Однако, в митохондриях большинства клеток костного мозга на фоне резко уплотненного матрикса было отмечено резкое расширение, разволокнение и деструкция митохондриальных крист, свидетельствующие о митохондриальной дисфункции данных клеток (Рисунок 1). Повреждение системы развитых митохондриальных крист с локализованными в них дыхательными ферментами приводит к снижению продукции АТФ и недостаточности энергоснабжения клеток. В настоящее время вторичная митохондриальная недостаточность расценивается, как патогенетическое звено многих хронических заболеваний. [2,5]. На месте измененных митохондрий формировались вторичные лизосомы. Дисфункция митохондрий отражалась и на снижении белкового синтеза, что проявлялось в расширении и дегрануляции эндоплазматического ретикулума, незрелости секреторных гранул. Отдельные клетки костного мозга подвергались отеку, некрозу и апоптозу. Известно, что признаки повреждения мембран и цитоскелета соответствуют интенсивности окислительного стресса в костном мозге и объясняются истощением митохондриального пула, как сигнального пути апоптоза.

Светооптическое исследование клеток костного мозга после культивирования выявило наличие крупных клеток со светлым ядром и менее крупных с гиперхромным ядром подковообразной формы и цитоплазматическими включениями – вакуолями и плотными гранулами .Электронномикроскопически цитоплазма клеток бластной формы характеризовалась обилием свободных рибосом, слабым развитием органелл и наличием митохондрий с матриксом пониженной электронной плотности и четкими кристами, что отражало высокий коэффициент фосфорилирования и низкий уровень макроэргических соединений     (Рисунок 2). Клетки с подковообразными ядрами имели более сложное строение. В цитоплазме располагались мелкие и гипертрофированные полости агранулярного эндоплазматического ретикулума с хлопьевидным и микровезикулярным материалом в просвете, расширенные цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума, заполненные белковым содержимым. Многие клетки содержали плотные секреторные гранулы. Митохондрии были полиморфны и не имели признаков деструкции.

Таким образом, прекультивирование клеток костного мозга устраняло дисфункцию митохондриального состояния культуральных клеток костного мозга больных с хронической сердечной недостаточностью.

Однако, наряду с митохондриями  промежуточного  и конденсированного  типа строения, в отдельных  случаях нами были отмечены митохондрии с признаками набухания, а также с зернисто дезорганизованными кристами на фоне уплотненного матрикса, что отражало усиление процессов окислительного фосфорилирования, обеспечивающих высокую биосинтетическую активность данных клеток. Деструкция отдельных митохондрий свидетельствовала о функциональном истощении данных органелл.

При введении фруктозо-1,6-дифосфата (FDP) в цитоплазме культуральных клеток электронно- микроскопически выявлены целые скопления электронно-плотных гранул гликогена. Как известно, введение FDP при гипоксии обеспечивает запасы гликогена, связанные с адекватным течением анаэробного гликолиза [10]. Особого влияния FDP на структуру митохондрий мы не отметили. При добавлении в питательную среду антигипоксантных веществ («Неотона») ультраструктура митохондрий с матриксом умеренной электронной плотности и четкими кристами отражала энергизированное состояние данных органелл. Таким образом, добавление в процессе прекультивирования в питательную среду энерготропных средств уменьшало деструктивные изменения митохондрий, повышая энергетический статус культуральных клеток.

Оценка острых эффектов процедуры клеточной терапии показала, что внутривенное введение клеток не вызывало каких-либо серьезных осложнений, гемодинамика оставалась стабильной, не выявлено аллергической реакции. В общем анализе крови, который исследовался в день трансплантации (утром) и через 2 часа после трансплантации, у больных отмечено умеренное повышение лейкоцитов, которое уже не регистрировалось в анализе крови, взятом на следующий день после процедуры. Субъективное улучшение качества жизни по данным Миннесотского опросника после пятикратного введения аутологичных клеток костного мозга отмечали все 41 (89,1%) пациента. Толерантность к физической нагрузке при проведении теста с 6-минутной ходьбы статистически значимо увеличилась через 3 месяца после введения МККМ (Р<0,01) по сравнению с исходным значением.

 

Таблица 2 

Динамика параметров после клеточной терапии при ДКМП

Исходно

ч/з 3мес.

ч/з 6мес.

ч/з 9мес.

ч/з 12мес.

ФВ (%)	32,1±1,3	34,1±1,5	32,8±2,08	30,9±1,3	41,3±1,6*
КДО (ml)	212,6±10,1	208,3±10,9	204±9,81	192,1±14,1	155,5±24,9*
КСО (ml)	145,9±8,5	140,6±9,4	143,1±9,6	147,1±14,1	141,33±20,5
Pro-BNP (ng/ml)	4618±267	1876±392	1154±365	1005±54,6	286±35,9*
IL-6 (pg/ml)	6,6±2,1	3,2±6,7	2,4±0,95	2,51±3,1	1,76±0,63*
IL-10 (pg/ml)	5,84±4,7	8,3±1,2	19,6±4,1	19,9±3,6	19,8±4,8*
*достоверность в сравнении с исходными данными

 

У пациентов с дилатационной кардиомиопатией на фоне повторной трансплантации аутологичных клеток КМ анализ параметров сердечной функции по данным ЭХОКГ выявил увеличение фракции выброса левого желудочка с 32,1±1,3% до 41,3±1,6%, (Р<0,001). Достоверное  уменьшение конечно диастолического объема (КДО) с 212,6±10,1 мл до 155,5±24,9 мл, (Р<0,05) и снижение конечно-систолического объема (КСО), но недостоверно (Р>0,05), что свидетельствует об улучшении систолической функции левого желудочка с уменьшением полости сердца и регрессом клиники хронической сердечной недостаточности.

Динамика раннего маркера сердечной недостаточности Pro-BNP после трансплантации МККМ показал, что после первой же трансплантации снижается в 2 раза и к концу 4-х кратного введения приходит в норму (4618±267 ng/ml и 286±35,9 ng/ml, соответственно Р<0,0001). Также нами установлено, значимое повышение противовоспалительного интерлейкина- 10 (5,84±4,7 до 19,8±4,8; Р<0,001) и снижение провоспалительного интерлейкина – 6 (6,6±2,1 до 1,76±0,63 соответственно, Р<0,001).

Обсуждение.

Таким образом, полученные нами результаты комплексного лечения больных с хронической сердечной недостаточностью системным введением прекультивированных аутологичных клеток костного мозга показали, что системное повторное введение данных клеток безопасно и хорошо переносится пациентами. Ни у одного больного не было отмечено развития онкологических заболеваний (онкомаркеры перед каждым введением МККМ были в пределах нормы), иммунных реакций, обострения воспалительных заболеваний, угрожающих нарушений ритма сердца, ухудшения течения ишемической болезни сердца, развития или прогрессирования хронической сердечной  недостаточности. На фоне клеточной  терапии, аутологичными МККМ уменьшалась полость левого желудочка, улучшалась систолическая функция миокарда, снижалась ФК ХСН по NYHA, что подтверждалось достоверным снижением раннего биологического маркера сердечной недостаточности - натрийуретического пептида. Также установлена возможность улучшения морфо-функционального состояния деэнергезированных культуральных клеток путем прекультивирования и введения ряда энерготропных фармакологических препаратов.

Выводы.

1.     Трансплантация аутологичных прекультивированных мононуклеарных клеток костного мозга при ДКМП является безопасной процедурой.

2.     Повторное введением прекультивированных МККМ в сочетании с оптимальной медикаментозной терапии ХСН приводит к улучшению общей и локальной сократительной функции миокарда, а также нормализации систолического и диастолического функции левого желудочка.

3.   Путем прекультивирования и введения ряда энерготропных фармакологических препаратов выявлено улучшение морфо-функционального состояния деэнергезированных стволовых клеток, включая усиление мощности митохондриального аппарата и синтеза защитных адаптивных белков.

 

Список литературы

1.     Карпов Р.С., Марков В.А., Рябов В.В., 2009, «Теоретические аспекты клеточных технологий в кардиологии и результаты собственного исследования», Сборник трудов к 80-летию ак.Е.И.Чазова, сс.104-115.

2.     Клембовский А.И., Сухлруков В.С. Проблема энергетической дисфункции клеток при патологии человека (патогенез и коррекция). Вестник Российской академии естественных наук.-2007.№4.-С.62-69.

3.     Маслов Л.Н., Рябов В.В., Сазонова С.И., 2003. «Клеточная трансплантация в лечении инфаркта миокарда:проблемы и перспективы», Вестн.трансплантол. и искусствен.органов, Vol.4, сс.78-86.

4.     Маслов Л.Н., Рябов В.В., Сазонова С.И., 2004. «Регенерация миокарда». Успехи физиологических наук.Vol.3, сс.50-60.

5.     Постнов Ю.В. О энергозависимом звене патогенеза хронической гипертензии. Архив патологии.-2009.-№4.-С.3-11.

6.     Репин В.С., Сухих Г.Т., 1998. Медицинская клеточная биология. М., РАМН: БЭБиМ.

7.     Степанов О.В., Чадин А.В., Масютин А.Г. и др.,2011. «Миозинактивирующие протеинкиназы – возможные регуляторы немышечного миозина в развивающемся сердце человека», Бюллетень эксп. биологии и медицины, Vol.152, .№152.-С.158-161.

8.     Секамова С.М., Бекетова Т.П. О функциональном значении темных и светлых клеток. Архив патологии.- 1975.-№ 5.-С.57-64

9.     Humphrey C, Pittman F.    A simple methylene blue-azure II-basic fuchsin stain for epoxy-embedded tissue sections. Stain Technol. 1974- 49:9–14

10. FDP. Метаболическая поддержка при экстремальных состояниях. Общая характеристика препарата.Консорциум «Медэкспорт Италия». Компания «Физиофарма».2006.-12 с.