Создание и применение фармацевтических препаратов растительного происхождение наряду с препаратами, получаемыми путем химической технологии органического синтеза – актуальное направления современной медицины. Потребность в данном классе препаратов обусловлена тем фактом, что фитопрепаратам свойственны мягкость терапевтического действия и отсутствие выраженных побочных эффектов, а так же их действие в организме является комплексным. Такие препараты широко применяются в мировой медицинской практике для профилактики  и эффективного лечения различного рода заболеваний [3]. В настоящее время исследования по поиску новых лекарственных средств направлены на изучение, получение и внедрение в производство экстрактов растений, действующими веществами которых обычно является целый ряд биологически активных веществ. Именно компонентный состав данных субстанций обуславливает их фармакологическое действие и физико-химические свойства.

Еще одним весомым аргументом, дающим обоснование актуальности данного вопроса, является стратегия фармацевтического рынка Российской Федерации, ориентированная на импортозамещение лекарственных средств, в том числе препаратов растительного происхождения.

Перспективным объектом в этом отношении представляется многолетнее травянистое растение семейства губоцветных зюзник европейский. Трава зюзника европейского является сырьем для получения экстракта, обладающего тиреотропной активностью, что было доказано в результате проведенных исследований [1, 2]. По данным фитохимического изучения в составе зюзника европейского травы обнаружены такие вещества как: кофейная кислота, этиловый эфир кофейной кислоты, протокатеховый альдегид; 5, 3, 4 – тригидрокси - 6, 7 – диметоксифлавон, апигенин, розмариновая кислота, метиловый эфир розмариновой кислоты, лютеолин, мезоинозит, метиловый эфир лютеолин – 7 – глюкуронида, этиловый эфир– 7 – глюкуронида, этиловый эфир апигенина и глюкоза [4,5].

Неотъемлемой частью создания препарата является разработка методик, позволяющих контролировать его качество. В этой связи целью нашего исследования явилась разработка и валидация методики количественного определения суммы фенольных соединений в данном сырье.

Объектом исследования служило сырье зюзника европейского, заготовленное в 2014 году в Ростовской области. При разработке методики количественного определения суммы фенольных соединений (с.ф.с.) был изучен спектр поглощения спирто-водного извлечения из травы зюзника. Согласно полученным данным в диапазоне длин волн от 300 до 400 нм исследуемое извлечение имеет максимум поглощения при длине волны 327±2 нм. Аналогичный максимум поглощения имеет раствор стандартного образца (СО) розмариновой кислоты (Рисунок 1). Полученный результат позволяет проводить количественное определение суммы фенольных соединений в траве зюзника в пересчете на розмариновую кислоту.

В ходе исследования были подобраны оптимальные условия для проведения экстрагирования и количественного определения фенольных соединений в траве исследуемого растения. Установлено, что максимальный выход изучаемой группы биологически активных веществ достигается при температурном режиме 60°С, где экстрагентом является спирт этиловый 40%-ный. На основании данных, полученных при проведении скрининга (Табл.1-3), экстрагирование из 1 г сырья целесообразно проводить 100 мл спирта при измельчении сырья не более 0,5 мм в течение 1 часа.

Таблица 1 Выход суммы фенольных соединений в зависимости от соотношения сырье: экстрагент. (Условия экстракции: T = 60°С, t = 40 мин, Степень изм. ≤ 1 мм.)

Вариант	mсырья/Vэкстрагент, г/мл	Выход с.ф.с.,%
1	1/50	7,15±0,18
2	1/100	7,20± 0,13
3	1/150	7,21± 0,15
4	1/200	7,53± 0,12

Таблица 2 Выход суммы фенольных соединений в зависимости от степени измельчения сырья. (Условия экстракции: T = 60°С, t = 40 мин, Vэкстрагента = 100 мл.)

Вариант	Степень измельчения, мм	Выход с.ф.с.,%
1	≤ 0,5	7,81± 0,15
2	≤ 1	7,26± 0,19
3	≤ 2	7,16± 0,11
4	≤ 3	5,19±0,07

Таблица 3

Выход суммы фенольных соединений в зависимости от времени экстракции. (Условия экстракции: T = 60°С, Vэкстрагента = 100 мл, Степень изм. ≤ 0,5 мм.)

Вариант	Время, мин	Выход с.ф.с., %
1	30	6,72± 0,13
2	60	7,86± 0,14
3	120	7,90±0,13
4	180	7,96± 0,09
5	240	7,91±0,11

 

Описанные выше условия позволили  разработать методику количественного определения суммы фенольных соединений.

Валидация разработанной методики проведена по следующим показателям: специфичность, линейность, правильность, внутрилабораторная прецизионность: сходимость и воспроизводимость методики.

Специфичность методики характеризуется совпадением максимумов поглощения спиртового извлечения

из зюзника европейского травы и раствора СО розмариновой кислоты при длине волны 327±2 нм.

Определение линейности проводилось на 7 уровнях концентраций СО розмариновой кислоты в диапазоне 2,3 – 10,5 мгк/мл (Рисунок 2). По результатам проведенных исследований установлено, что зависимость носит линейный характер, коэффициент корреляции  (R 2) составил  0,999, что близко к  единице и  соответствует критерию приемлемости (R 2 не ниже 0,995).

Контроль правильности методики проводился на модельных смесях трех концентраций с содержанием СО розмариновой кислоты 25, 50, 75% к ее исходной концентрации в спиртовом извлечении из сырья зюзника (Табл.4).

Таблица 4

 Контроль правильности методики

№ п/п	Найдено, мг	Добавлено СО, мг	Ожидаемое значение, мг	Полученное значение, мг	Абсолютная ошибка, мг	Выход с.ф.с., %
1.1	86,2	22,4	108,6	106,6	- 2,0	98,13
2.1	83,8	43,6	127,4	127,1	- 0,3	99,76
3.1	84,8	62,8	147,6	148,0	+ 0,4	100,30
1.2	94,2	22,6	116,8	114,5	- 2,3	98,04
2.2	92,3	45,2	137,5	135,6	- 1,9	98,64
3.2	91,8	70,7	162,5	162,6	+ 0,1	100,06
1.3	73,1	19,7	92,8	90,3	- 2,5	97,33
2.3	73,3	38,9	112,2	112,8	+ 0,6	100,53
3.3	77,7	56,0	133,7	131,3	- 2,4	98,21
Среднее значение выхода, %				99,00

 

В разработанной методике процент восстановления (выход) находится в пределах от 97,33% до 100,53% , что отвечает требованиям критерия приемлемости (от 95% до 105%).

Для установления сходимости провели шесть параллельных определений на основании результатов которых (Табл.5) вычислили величину стандартного отклонения (S=0,185), относительной вероятной погрешности отдельного измерения (±1,76%) и коэффициента вариации. Значение коэффициента вариации 2,41% (критерий приемлемости: не более 5%), что свидетельствует о прецизионности методики по сходимости.

Внутрилабораторную воспроизводимость определяли два аналитика на девяти повторностях образца сырья зюзника европейского травы каждый, приготовленных независимо друг от друга в течение трех дней (Табл.6).

В результате проведенных исследований установлено, что коэффициент вариации (7,21%) не превышает 10%, что позволяет считать внутрилабораторную воспроизводимость результатов методики приемлемой.

 

Таблица 5 

Контроль сходимости методики

№ п/п	Выход суммы фенольных соединений., %
1	7,99
2	7,60
3	7,48
4	7,63
5	7,81
6	7,58

Таблица 6

Контроль внутрилабораторной воспроизводимости методики

Аналитик	День	Выход с.ф.с., %
		Обр.1	Обр.2	Обр.3
1	1	8,16	7,57	8,02

	2	7,45	7,89	7,50
	3	6,83	7,05	6,90
2.	1	8,04	7,99	7,60
	2	7,81	7,63	7,58
	3	6,54	6,56	6,71

 

На основании полученных результатов разработана методика количественного определения суммы фенольных соединений в пересчете на розмариновую кислоту в зюзника европейского траве, которая оценена положительно по параметрам: специфичность; линейность; правильность; сходимость; внутрилабораторная воспроизводимость. Данная методика может быть включена в проект нормативной документации на новый вид лекарственного сырья – зюзника европейского трава.

 

Список литературы

1.     Айвазова А.С. Изучение тиреотропных свойств зюзника европейского (Lýcopus europaéus L): автореф. дисс….канд. биол. наук: 14.00.25 / Айвазова Аревик Степановна.- Москва.-2008.

2.     Айвазова, А.С. Изучение тиреотропных свойств травы зюзника европейского Lycopus europaeus L. /А.С. Айвазова, В.К. Колхир, Т.Е. Трумпеи др. // Вопросы биологической медицины и фармацевтической химии.-2008. -№1. -С.34-37.

3.     Муравьева, Д.А. Фармакогнозия / Д.А. Муравьева, И.А. Самылина, Г.П. Яковлев. – М.: Медицина, 2002. – 656 с.

4.     Шелухина, Н.А. Изучение химического состава зюзника европейского (Lycopus europaeus L.) / Н.А. Шелухина, А.А. Савина, В.И. Шейченко и др. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. -2010. -№11. -С.7-11.

5.     Шелухина Н.А., Изучение химического состава травы зюзника европейского (Lýcopus europaéus L.) / Н.А. Шелухина, А.А. Савина, В.И. Шейченко и др. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. -2011. -№3. -С.6-9.