ЭНДОТОКСИН-СВЯЗЫВАЮЩИЙПОТЕНЦИАЛ МОНОЦИТОВ И ГРАНУЛОЦИТОВ И УРОВЕНЬ СИСТЕМНОГО ВОСПАЛЕНИЯ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ ПОЧЕК НАХОДЯЩИХСЯ НА ГЕМОДИАЛИЗЕ

Резюме
Главная причина смертности больных хронической болезнью почек (ХБП), находящихся на программном гемодиализе (ГД), являются сердечно-сосудистые заболевания. Бактериальный эндотоксин играет важную роль в развитии и поддержании хронического воспаления, которое вызывает развитие сердечно-сосудистых заболеваний. Методы: обследовано 30 больных ХБП на программном ГД возрасте от 20 до 69 лет, 16 женщин и 14 мужчин. Экспрессию эндотоксин-связывающих рецепторов (ЭТ-Р) различных типов на моноцитах и гранулоцитах периферической крови изучали методом проточной лазерной цитофлюорометрии. Концентрацию С-реактивногобелка (СРБ) в крови определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа. Контрольную группу составили 20 практически здоровых доноров. Результаты у больных ХБП ГД зарегистрировано повышение уровня экспрессии ЭТ-Р на моноцитах периферической крови доMе = 2,44 (2,28- 2,58), при норме Mе = 2,01 (1,83-2,34), p = 0,008. Кроме этого, имеет место повышение уровня СРБ доMе = 11,4 (7,9-47,5), при норме Mе = 1,4 (0,6-2), р<0,001. Количество ЭТ-Р на гранулоцитах не отличалось от показателей нормы. Выводы: у больных ХБП на ГД моноциты периферической крови находятся в активированном состоянии. Активация моноцитов сочетается с высоким уровнем СРБ и может быть ответственной за поддержание хронического воспаления в этой категории больных.
Ключевые слова: хроническая болезнь почек, гемодиализ, воспаление, эндотоксин, эндотоксин- связывающие рецепторы, С-реактивный белок.

ENDOTOXINBINDING POTENTIAL OF MONOCYTES AND GRANULOCYTES AND LEVEL OF SYSTEMIC INFLAMMATION IN PATIENTS WITH CHRONIC KIDNEY DISEASE ON HEMODIALYSIS

Klimchuk A.V.

State Establishment «Crimean State Medical University named afterS.I. Georgevsky», Department of Internal Medicine№ 2, с.Simferopol.

The main cause of mortality in patients with chronic kidney disease (CKD) on hemodialysis (HD) is cardiovascular disease. Bacterial endotoxin plays a role in the development and maintenance of chronic inflammation which contributes to the development of cardiovascular diseases.Methods: 30 patients with CKD on HD in age from 20 to 69 years, 16 women and 14 men were studied. Expression different typesendotoxinbinding receptor (EBR) on monocytes and granulocytes of peripheral blood was studied by flow cytofluorometry laser. The concentration of C-reactive protein (CRP) levels was determined by ELISA. The control group consisted of 20 healthy people.Results: the patients with CKD on HD have increase level of EBR expression on peripheral blood monocytes to Me=2,44 ( 2,28-2,58 ), when norm level was Me=2,01 (1,83-2,34), p = 0,008. In addition there is a raised CRP levels to Me=11.4 ( 7,9-47,5 ), norm level was Me=1.4 ( 0.6-2 ), p < 0.001.Conclusion: in patients with CKD on HD peripheral blood monocytes are in an activated state. Activation of monocytes combined with high CRP levels and may be responsible for the maintenance of chronic inflammation in this population of patients.
Keywords: chronic kidney disease, hemodialysis, systemic inflammation, endotoxin, endotoxinbinding receptors, C- reactive protein.

Введение
Ведущей причиной смертности среди пациентов с хронической болезнью почек (ХБП) являются сердечно- сосудистые заболевания (ССЗ)[4,12,16,23]. У больных ХБП на гемодиализе (ГД)кроме традиционных факторов риска ССЗ имеются дополнительные.Дополнительные факторы риска ССЗ, такие как нарушение кальциево- фосфорного обмена, системное воспаление и др.,у этих больных могут приобретать решающее значение. Известно, что даже субклиниченский уровень системного воспаления может играть важную роль дестабилизации атеросклеротической бляшки, а воспалительные маркеры, такие как С-реактивный белок (СРБ) включены в алгоритмы оценки степени риска ССЗ [13,21,22,19,24].
Одним из мощных факторов индукции и самоподдержания системного воспаления может является эндотоксин (ЭТ) грамнегативных бактерий,составляющих до 70% бактерий в здоровом кишечнике человека. ЭТ представляет собой липополисахарид (ЛПС) наружной мембраны бактериальной клетки и является в норме одним из важных стимулов для иммунной системы человека. ЭТ постоянно высвобождается в небольших количествах в процессе жизнедеятельности и гибели бактериальной клетки. Молекулы ЭТ всасываются из кишечника и выявляются в норме в системной циркуляции в низкой концентрации от 1 до 200 пг/мл [11]. Избыток ЭТ в системной циркуляции и/или дисфункция ЭТ-связывающих систем может приводить от субклинической эндотоксинемии до ЭТ шока [25,5,12]. Интегральный эффект воздействия ЭТ во многом определяется состоянием специфических ЭТ-связывающих клеточных рецепторов. Клеточные рецепторы, принимающие участие в распознавании ЭТ и активации путей внутриклеточной передачи сигнала, а также в нейтрализации и его клиренсе, это CD14, 2-интегриновые рецепторы (CD11/CD18), L-селектины и др.[6].
Целью нашей работы было изучить ЭТ-связывающий потенциал моноцитов и гранулоцито - впериферической крови и уровень маркеров системного воспаления у больных ХБП находящихся на программном ГД.
Материалы и методы
В условиях отделения интенсивной нефрологии и диализа КРУ «КТМО Университетская клиника» г. Симферополя было обследовано 30 больныхс ХБП V стадии, пролонгированной ГД в возрасте от 20 до 69 лет. В группе обследованных было 16женщин и 14 мужчин. Все пациенты получали сеансы программного ГД 3 раза в неделю, длительность сеанса составляла 4-5 часов. Диализ проводился на аппаратах «искусственная почка» АК- 95 (Швеция) и «TINA» (США) с использованием бикарбонатного буфера. Использовался диализатор GFS-16, мембрана – гемофан фирмы «Gambro» (Швеция). Кровь из вены брали непосредственно перед проведением процедуры ГД. Контрольную группу составили 20практически здоровых людей, соответствующих больным ХБП по возрастному диапазону и половому распределению. ЭТ-связывающий потенциал моноцитов и гранулоцитов (ЭТ-Р) периферической крови определяли методом проточной лазерной цитофлуориметрии, используя в качестве флуоресцентного зонда коньюгатлипополисахарида с флуоресцеинизотиоцианатом (LPS-Fits) [1,3]. Лейкоциты выделяли из образцов ПК 50 практически здоровых людей путем разрушения эритроцитов лизирующим раствором на основе хлорида аммония. К 100 мкл цельной стабилизированной крови (использовали стандартный стабилизатор на основе 3,8% цитрата) прибавляли 3 мл рабочего разведения (1:10) лизирующего раствора, перемешивали и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре (18-20С). Лейкоциты осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин, трижды промывали 3 мл 0,01 М фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 1%-й NaCl и 0,05%-й NaN3 (PBS-NaN3), после чего ресуспендировали в 100 мкл PBS-NaN3. При необходимости выделенные лейкоциты хранили не более 2 часов при комнатной тимпературе (18-22С). Затем к 25 мкл суспензии лейкоцитов прибавляли 12,5 мкл раствора коньюгата LPS-Fits в рабочем разведении 1:20 (концентрация ЛПС 50 мкг/мл) и 12,5 мкл бычьего сывороточного альбумина (0,6 мг/мл) (БСА; SigmaChem.Co.,USA). Для разведения ингредиентов использовали PBS-NaN3. Контролем служил PBS-NaN3.После тщательного перемешивания пробирки инкубировали в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре (18-20С).
Затем в пробирки вносили по 1 мл PBS-NaN3, снова перемешивали и анализировали на проточном цитофлуориметреPASIII (PartecGmbH, Munster, Germany). Для сбора и анализа результатов использовали программное обеспечение PartecFloMax V. 2.4d, а также WinMDI 2.8 (JosephTrotter, ScrippsInstitute, LaJolla, CA). Для каждого образца регистрировали не менее 10 тысяч клеток, для которых фиксировали параметры переднего (Forward-scatteredlіght, FSC) и бокового (Sіdе-scatteredlіght, SSC) светорассеяния в линейном масштабе, а также флуоресценции по каналу FL1 в четырехрозрядном логарифмическом масштабе. Средняя интенсивность флуоресценции моноцитов или гранулоцитов характеризует уровень экспрессии этими клетками ЭТ- связывающих рецепторов.Концентрацию СРБ в крови определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА) с использованием протоколов, разработанных в отделе клинической иммунологии ЦНИЛ ГУ «Крымский государственный медицинский університет им. С.И. Георгиевского» [2]. Концентрацию СРБ выражали в мг/л.
Статистическая обработка полученных результатов проведена с использованием лицензионной программы «MedStat» (серийный №MS0011 ДНПП ТОВ «Альфа», г. Донецк) для параметрических и непрараметрических критериев.
Результаты и обсуждение
Результаты изучения уровняэкспрессии и ЭТ-Р на моноцитах и гранулоцитах периферической крови, а также уровень СРБ у больных ХБП, находящихся на программном ГД представлены в таблице.

                                                                                                                             Таблица 1

 ЭкспрессияЭТ-связывающих рецепторов на моноцитах и гранулоцитах и уровень СРБ в периферической крови у больных ХБП на ГД.

Примечание: Mе – медиана, M – средняя, p – достоверность различий с контрольной группой практически здоровых людей.

Экспрессия ЭТ-Р у этой категории больных достоверно (р=0,008) выше в 1,2 раза, чем у доноров. Экспрессия ЭТ-Р на гранулоцитах у больных ХБП не выходит за рамки нормы для этих показателей. Кроме этого, у этих же больных мы наблюдаем высокий уровень СРБ (p<0,001), который в 8,1 раза превышает показатели доноров.
В настоящее время признано, что эндотоксинемия является фактором риска раннего атеросклероза у пациентов с хроническими и рецидивирующими бактериальными инфекциями. Недавние исследования показали, что циркуляция микробных продуктов, вероятно происходивших из желудочно-кишечного тракта, является причиной системной иммунной активации у больных ВИЧ-инфекцией [7]. Кроме этого существуют исследования продемонстрировавшие, что инъекция ЭТ приводит к значительному снижению эндотелиальных клеток предшественников, что является предиктором ССЗ [17]. Известно так же, что наличие уремии уже создает благоприятную среду для транслокации ЭТ из кишечника. В условиях экспериментальной уремии на крысах было продемонстрировано, что она индуцирует нарушение кишечного слизистого барьера и бактериальнуютранслокацию[8]. Известно, что пациенты с ХБП подвергаются значительнойэндотоксинемии.Циркуляторная эндотоксинемия увеличивается с ростом стадии ХБП и её резкий подъем наблюдается у пациентов с терминальной хронической почечной недостаточностью (ТХПН) при начале ГД. По данным авторов, эндотоксинемия ассоциируется с системным воспалением и с риском смертности среди этих больных [18].
Как известно, CD14 является главным рецептором, принимающим участие в активации моноцитов комплексом, состоящим из ЭТ и липополисахарид-связывающего белка (ЛСБ). Активированный CD14, не имея внутрицитоплазматического домена, передает сигнал внутрь клетки посредством корецепторных взаимодействий с Toll-like рецепторами 4 типа (TLR-4), что в конечном итоге ведет к активации внутриклеточных сигнальных путей и продукции провоспалительных цитокинов (TNF-, IL1 и др.), молекул клеточной адгезии (ICAM-1, ICAM-3, VCAM, Е-селектин) и других медиаторов воспалительной реакции [9]. Концентрация ЭТ 0,01 нг/мл индуцирует повышенную CD14-экспрессию и стимулирует активацию цитокинов и других провоспалительных факторов. В крови белок CD14 присутствует в растворимой форме (sCD14) и мембрано-связанной (mCD14). В то время как mCD14 стимулирует высвобождение провоспалительных цитокинов и активных форм кислорода, sCD14 увеличивается в ответ на ЛПС. Исследования показали ассоциацию sCD14 и маркеров воспаления. Также обнаружено, что повышение sCD14 было связанно со смертностью больных ХБП, находящихся на ГД [10].
Кроме CD14 существуют и другие рецепторы, для которых лигандом является ЭТ. К ним относятся “scavenger”- рецепторы (SR) макрофагов и 2-интегриновые рецепторы (CD11/CD18). Если активация CD14 приводит к инициации провоспалительного ответа, то взаимодействие ЭТ с SR и CD11/CD18 ведет к нейтрализации его биологической активности путем деацетилирования и дефорфорилирования или при определенных условиях путем активации NF-не зависимого от CD14\TLR 4 типа [6].
В нашем исследовании мы наблюдаем повышение на моноцитах количества ЭТ-рецепторов, что свидетельствует об активации моноцитовбольных ХБП на ГД. Известно, чторецепторы CD14 играют важную роль в активации макрофагов, а при определенных условиях возможна активацияNF-через другие ЭТ- рецепторы.Кроме этого в условиях повышенной нагрузки ЭТ, описанной многими авторами у больных ТХПН на программном ГД, возникает необходимость в деактивации ЭТ, которую берут на себя, в том числе, и другие ЭТ- рецепторы на макрофагах и гранулоцитах.Уровень ЭТ-рецепторов на гранулоцитах, не отличающийся от показателей здоровых доноров, свидетельствует о том, что деактивация ЭТ гранулоцитами в условиях эндотоксинемии, наблюдающейся у больных ХБП на ГД, недостаточна.Активация макрофагов под воздействием ЭТ, наблюдающаяся у больных ХБП на ГД, ассоциируется со значительным системным воспалением, и вероятно, вносит свой вклад в развитие сердечно-сосудистых событий, широко распространенных у пациентов с ХБП на программном ГД, и являющихся их главной причиной смертности. Понимание этих механизмов представляет возможность для поиска новых терапевтических стратегий по снижению сердечно-сосудистой смертности у этой категории пациентов.
Выводы
1. У больных ХБП на ГД моноциты периферической крови находятся в активированном состоянии: зарегистрировано повышение на них экспрессии ЭТ-Р (p=0,008).
2. ЭкспрессияЭТ-связывающихрецепторов на гранулоцитах у больных ХБП на ГД не отличается от показателейнормы.
3. Активация моноцитов сочетается с достоверно высоким уровнем СРБ (р<0,001).
4. Дальнейшее изучение патофизиологических механизмов развития хронического воспаления у больных ХБП на программном ГД будет иметь важное значение для улучшения качества жизни и уменьшения смертности в этой категории пациентов.

Список литературы

1. Гордієнко А.І. Метод визначення ендотоксинзв’язуючих рецепторів на моноцитах і гранулоцитах периферичної крові. / Гордієнко А.І., Білоглазов В.О., Хіміч Н.В.// Інформаційний лист про нововведення в системі охорони здоров’я №122.- К., УКРМЕДПАТЕНТ ІНФОРМ, 2010.- 4 с.
2. Гордієнко А.I., Бiлоглазов В.О., Бакова А.А. Високочутливийімуноферментний метод кількісноговизначеннязмісту С-реактивного білка в крові. Інформаційний лист про нововведеннявсистеміохорониздоров'я №139.- К., УКРМЕДПАТЕНТIНФОРМ, 2010.- 4 с.
3. Гордиенко А.И. Улучшенный метод получения флуоресцентного зонда для определения липополисахарид-связывающих рецепторов методом проточной лазерной цитофлуориметрии./ Гордиенко А.И. //Таврический медико-биологический вестник.- 2007.- 10, №4.- С. 156-160.
4. Al-DadahA. Cardiovascularmortalityindialysispatients. / Al-DadahA, OmranJ, NusairMB [etal.] // AdvPeritDial. – 2012 – Vol. 28 - P. 56.
5. Aline B Hauser. A gut feeling on endotoxemia: causes and consequences in chronic kidney disease. / Aline B. Hauser, Andréa E. M. Stinghen, Simone M. Goncalves [et al.]. // Nephron ClinPract . - 2011. - Vol.118.-Р. c165- c172.
6. Antal-Szalmás P. Evaluation of CD14 in host defence./Antal-Szalmás P. //European Journal of Clinical Investigation.- 2000.- 30, N2.- P. 167-179.
7. Brenchley J.M. Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection. / Brenchley J.M., Price D.A., Schacker T.W. [et al.]// Nat Med – 2006 - Vol.12 – p. 1365–1371.
8. de Almeida Duarte J.B. Bacterial translocation in experimental uremia./ de Almeida Duarte J.B., de Aguilar- Nascimento J.E., Nascimento M [et al.]. // Urol Res. - 2004 - Vol.32 (4) –p. 266 - 270.
9. Dentener M.A. Systemic anti-inflammatory mediators in COPD: increase in soluble interkeukin 1 receptor II during treatment of exacerbations./ Dentener M.A., Creutzberg E.C., Schols A.M.W. [et al] // Torax.- 2001.- 56, N6.- P. 721-726.
10. Dominic SC Raj. Soluble CD14 Levels, Interleukin-6, and Mortality AmongPrevalent Hemodialysis Patients./ Dominic SC Raj, Juan J Carrero, Vallbh O Shah [et al] //Am J Kidney Dis. – 2009 - December 54(6) – p.1072– 1080.
11. ErridgeС, Attina T, Spickett CM, Webb DJ. A high-fat meal induces low-grade endotoxemia: evidence of a novel mechanism of postprandial inflammation. AmJClinNutr. 2007, V. 86. P. 1286 – 1292.
12. Foley RN. Epidemiology of cardiovascular disease in chronic renal disease. / Foley RN, Parfrey PS, Sarnak MJ //J Am SocNephrol - 1998- Vol. 9(12 Suppl) - P. S16–S23.
13. Hamann L. Components of gut bacteriaas immunomodulators. / Hamann L, El-Samalouti V, Ulmer AJ [et al] // Int J Food Microbiol.-1998. - Vol. 41. - P. 141–154.
14. Kim H.W. Microinflammation in hemodialysis patients is associated with increased CD14CD16(+) pro- inflammatory monocytes: possible modification by on-line hemodiafiltration./ Kim H.W., Yang H.N., Kim M.G. [et al] // Blood Purif. – 2011- №31(4) –р.281-288.
15. Jing-Hua Peng. Characteristics and causes of immune dysfunction related to uremia and dialysis. / Jing-Hua Peng, Tuan Cui, Zhao-Lin Sun, [et al.] // Peritoneal Dialysis International – 2008 - Vol. 28 , Suppl. 3 - P. S183-S187
16. Lindner A. Accelerated atherosclerosis in prolonged maintenance hemodialysis. / Lindner A, Charra B, Sherrard DJ, [et al.] // N Engl J Med – 1974 – Vol. 290 - P.697–701.
17. Mayr F.B. Effects of low dose endotoxemia on endothelial progenitor cells in humans./ Mayr F.B., Spiel A.O., Leitner J.M [et al.] // Atherosclerosis – 2007- Vol.191 –p. e202–e206.
18.McIntyreC.W.Circulatingendotoxemia: anovelfactorinsystemicinflammationandcardiovasculardiseaseinchronickidneydisease. / McIntyreC.W., HarrisonL.E., EldehniM.T., [etal.]// ClinJAmSocNephrol. – 2011 - Vol.6(1) – p.133-141
19. PaulMRidker. Inflammation, C-ReactiveProteinandAtherothrombosis/ PaulMRidker, JoshDSilvertown // JPeriodontol - August 2008 (Suppl.) –Vol. 79- p. 1544-1551.
20. Peter Libby. Inflammation and cardiovascular disease mechanisms./ Peter Libby.// Am J ClinNutr - 2006 - Vol. 83(suppl)- р. 456S– 460S.
21. Ramírez R. Evolution of the concept of biocompatibility and the cardioprotective effect of on-line hemodiafiltration./ Ramírez R, Martín-Malo A, Aljama P.// Contrib Nephrol.- 2011- № 175 –р.110-116.
22. Rene´ R. S. Packard. Inflammation in Atherosclerosis: From Vascular Biology to Biomarker Discovery and Risk Prediction./Rene´ R. S. Packard, Peter Libby.//Clinical Chemistry - 2008- Vol.54:1 -p. 24–38.
23. Shuichi Jono. Vascular calcification in chronic kidney disease. / Shuichi Jono, Atsushi Shioi, Yuji Ikari. [et al.] // Journal of Bone and Mineral Metabolism - 2006 – Vol. 24, Issue 2. – P. 176-181
24. Tuttolomondo A. Atherosclerosis as an inflammatory disease/ Tuttolomondo A, Di Raimondo D, Pecoraro R, [et al.]// urr Pharm Des.- 2012- Vol. 18(28) – p. 4266-4288.
25. Yang R.B. Toll-like receptor-2 mediates lipopolysaccharide-induced cellular signaling / Yang R.B., Mark M.R., Gray A., Huang A. [etal.] //. Nature – 1988- Vol.395. – P. 284–288.