Новости
12.04.2024
Поздравляем с Днём космонавтики!
08.03.2024
Поздравляем с Международным Женским Днем!
23.02.2024
Поздравляем с Днем Защитника Отечества!
Оплата онлайн
При оплате онлайн будет удержана комиссия 3,5-5,5%
Подпишитесь на нашу рассылку
Будьте в курсе всех наших новостей и мероприятий
|
ОЦЕНКА СТАБИЛЬНОСТИ МЕМБРАН АОРТЫ КРЫС ПОД ДЕЙСТВИЕМ L-АРГИНИНА
Рязань
04 января 2016г.
Лизосомы были случайно открыты при изучении Лувенской группой биохимиков, возглавляемой Кристианом Де Дювом, роли глюкозо-6-фосфатазы в механизме действия инсулина на печень.
В дальнейшем потребовались тщательные исследования для понимания того, что латентность кислой фосфатазы (КФ) проявляется из-за локализации ее в особых мешочкоподобных структурах, окруженных мембраной, нарушение целостности которой (при хранении, либо других воздействиях) значительно увеличивает возможность взаимодействия фермента с субстратом, а соответственно, и его активность. В первых биохимических исследованиях по изучению распределения КФ в клетке ее активность преимущественно выявлялась в митохондриальной фракции; поэтому предполагалось, что внутриклеточными частицами, содержащими этот фермент, являются митохондрии. Затем "митохондриальная фракция" была разделена на легкую и тяжелую субфракции, первая из которых и содержала КФ [8]. Авторы предположили, что частицы, содержащие данные ферменты, выполняют в клетках литическую функцию. Их обозначили термином "лизосомы", понимая под ними ограниченные мембраной гранулы, содержащие кислые гидролазы в латентной форме [8].
Лизосомы расщепляют биомакромолекулы, клеточные компоненты и бактерии; внутри лизосом поддерживается слабокислая среда, необходимая для проявления активности лизосомальных ферментов [1, 3, 6]. Лизосомальные мембраны разрываются при различных патологических процессах [2, 5, 9], что приводит к массивному выходу ферментов из них в цитоплазму, это сопровождается аутолизом тканей [4].
Материалы и методы
Работа выполнена на 12 конвенциональных половозрелых крысах-самцах линии Wistar массой 280-320 граммов. Моделирование изменения уровня синтеза оксида азота (II) субстратом NO-синтазы в экспериментальной группе (n=6), осуществляли путем внутрижелудочного введения раствора L-аргинина («Sigma», США) на 0,9 % растворе NaCl в дозе 500 мг/кг [3] ежедневно в течение 10 дней. Контрольной группе параллельно (n=6) внутрижелудочно вводили физиологический раствор.
Эксперимент проводился согласно «Международным рекомендациям по проведению медико- биологических исследований с использованием животных» (1985) и приказу МЗ РФ №267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики».
Активность кислых гидролаз в седиментируемой (СА) и неседиментируемой (НСА) фракциях определяли раздельно.
Общую активность (ОА) рассчитывали как сумму СА и НСА. Коэффициент лабильности (К лаб, %) – это процентное отношение НСА к ОА, характеризует проницаемость лизосомальной мембраны, для данного фермента.
Содержание белка определяли в седиментируемой и неседиментируемой фракциях гомогената по методу Лоури коммерческим набором НПЦ «Эко-сервис» (Санкт-Петербург).
Активность кислой фосфатазы определяли в седиментируемой и неседиментируемой фракциях гомогената унифицированным методом по «конечной точке», используя коммерческий набор «Витал Диагностикс СПб» (Санкт-Петербург).
Активность катепсинов В, L и Н изучалась спектрофлуориметрическим методом по Barrett & Kirschke [7]. Статистический анализ результатов исследования проведен с использованием программы «Statistica 10.0».
Поскольку отмечалось отсутствие согласия большинства данных с нормальным распределением, вычисляли характеристики: медиану (Ме), минимальное (min) и максимальное (max) значение (Ме [min; max]), для оценки статистической значимости различий независимых выборок использовали ранговый критерий Манна-Уитни (U- тест).
Результаты и их обсуждение
При сопоставлении активностей общей и тартратстабильной КФ контрольной и экспериментальной групп (Табл.1) выявлено однонаправленное действие в обеих фракциях: снижение проницаемости лизосомальных мембран.
Анализируя полученные коэффициенты КФ (таблица 2) наблюдаем однонаправленное действие соотношений ТСА/ОА и ТСА/ТЧА, указывающих на увеличение значений общей активности за счет обеих фракций КФ; коэффициент тартратчувствительной активности КФ снижается за счет показателей уменьшения проницаемости лизосомальной мембраны и общей активности (снижение внелизосомальной фракции КФ).
Таблица 1
Значение активностей общей и тартратстабильной фракции КФ в аорте крыс контрольной и экспериментальной групп, нмоль/с*г белка.
Группы сравнения
|
Общая КФ
|
Тартратстабильная КФ
|
Группа контроля
|
L-аргинин
|
Группа контроля
|
L-аргинин
|
НСА
|
875,01 [507,73; 1425,66]
|
302,47 [217,51; 404,66] *
|
548,49 [78,38; 1088,92]
|
240,13 [181,97; 287,79]
|
СА
|
529,71 [211,2; 2091,43]
|
1930,5 [1542,86; 4720]
|
298,99 [187,2; 1846,53]
|
1799,41 [1302,86; 2528]
|
ОА
|
1508,53 [718,93;
3309,47]
|
2194,2 [1947,51;
5108,38]
|
885,62 [265,58; 2859,15]
|
2017,66 [1520,4;
2753,75]
|
К лаб, %
|
61,5 [36,8; 71,3]
|
12 [7,6; 20,8] *
|
32,5 [17,9; 83,8]
|
12,5 [8,2; 17,6] *
|
Примечание: * - статистически значимые отличия от группы контроля (р<0,05)
Таблица 2
Коэффициенты оценки фракций КФ и аутокаталитического действия катепсинов, нмоль/с*г белка.
Группы сравнения
|
Контроль
|
L-аргинин
|
КФ
тартратчувствительная активность
|
НСА
|
383,04 [205,42; 447,62]
|
55,22 [4,91; 162,64] *
|
СА
|
171,49 [24; 363,36]
|
240 [29,27; 2192]
|
ОА
|
499,53 [450,32; 700,1]
|
332 [34,18;2354,64]
|
Клаб,%
|
65,1 [45,6; 94,7]
|
16,9 [5,4; 34,5] *
|
КФ соотношение ТСА/ТЧА
|
НСА
|
1,71 [0,18; 4,93]
|
3,93 [1,39; 58,6]
|
СА
|
5,74 [0,58; 7,8]
|
6,5 [1,15;65,8]
|
ОА
|
1,36 [0,59; 6,35]
|
5,64 [1,17; 64,77]
|
Клаб,%
|
0,5 [0,2; 1,7]
|
0,8 [0,3; 2,4]
|
КФ соотношение ТСА/ОА
|
НСА
|
0,46 [0,15; 0,83]
|
0,8 [0,58; 0,98]
|
СА
|
0,84 [0,37; 0,89]
|
0,86 [0,54; 0,99]
|
ОА
|
0,56 [0,37; 0,87]
|
0,84 [0,54; 0,99]
|
Клаб,%
|
0,7 [0,3; 1,2]
|
0,97 [0,85; 1,15]
|
Примечание: * - статистически значимые отличия от группы контроля (р<0,05)
Выводы
1. В ходе исследования обнаружено снижение внелизомальной фракции общей фракции КФ.
2. Однонаправленное действие в общей и тартратстабильной фракциях КФ указывает на снижение проницаемости лизосомальных мембран.
3. Коэффициент тартратчувствительной активности КФ снижается в показателях внелизосомальной фракции и проницаемости лизосомальной мембраны.
Список литературы
1. Дин Р. Процессы распада в клетке / Р.Дин. М.: Мир, 1981. - 120 с.
2. Маянская Н.Н. Лизосомы и регенерация / Н.Н. Маянская // Современные проблемы регенерации. Йошкар- Ола, 1982. - С. 135-142.
3. Покровский М.В. Эндотелиопротекторные эффекты L-аргинина при моделировании дефицита окиси азота. / М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Корчаков [и др.] // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2008. – Т.71- № 2. – С. 29–31.
4. Романов Б.К. Активность лизосомальных ферментов новый диагностический и прогностический критерий оценки степени повреждения кардиомиоцитов / Б.К.Романов // Рос. медико-биол. вестн. им.акад.И.П.Павлова - 2004. -№ 1-2. - С. 155-163.
5. Романов Б.К. Влияние верапамила на активность лизосомального аппарата миокарда при гипоксической гипоксии / Б.К.Романов // Пути формирования и коррекции физического состояния организма: Сб.науч.тр. Рязань, 1994. - Т 2. - С. 80-82.
6. Тутельян В.А. Лизосомы в деятельности клетки. Физиология и патология / В.А.Тутельян, А.В.Васильев // Вестн. АМН СССР. 1990. - N 2. -С. 14-21.
7. Barrett A.J. Cathepsin B, Cathepsin H, cathepsin L / A.J. Barrett., H. Kirschke // Methods in Enzymol. – 1981. – Vol. 80. – P. 535-561.
8. De Duve C. Function of lysosomes / C. De Duve, R. Wattiaux // Ann. Rev. Phisiol. 1966. - V. 28. - P. 435-492.
9. Wattiaux R. Effects of ischemia on lysosomes / R.Wattiaux, S. Wattiaux-De Coninck // Internat. Rev. Exper. Pathology / Eds.: Richter G., Epstein M. -New York., 1984. Vol. 26. - P. 85-107.
|
|