07 марта 2016г.
Флавоноидами называется группа фенольных соединений с двумя ароматическими кольцами, объединенных общим структурным составом С6-С3-С6. Известно более 6500 флавоноидов [6].
Животные и человек не способны синтезировать соединения флавоноидной группы, поэтому необходимо употреблять достаточное количество продуктов, в которых они содержатся. Флавоноидам присуща высокая биологическая активность, обусловленная присутствием в молекуле активных фенольно гидроксильных и карбонильных групп. Флавоноиды, поступающие в организм человека восстанавливают проницаемость капилляров, оптимизируют периферическое кровообращение, способствуют нормализации липидного состава крови, проявляют антибактериальную и антивирусную активность.
Забайкальский край является уникальной территорией с точки зрения богатства флоры и фауны. Забайкалье характеризуется большим многообразием дикорастущих ягодных кустарников, содержащих флавоноиды. Флавоноидный состав ягодного сырья, произрастающего в Забайкалье, не изучался, в связи с этим исследования содержания биологически активных веществ в ягодах представляет значительный теоретический и практический интерес. В качестве объектов для изучения нами выбраны дикорастущие ягоды Петровск – Забайкальского и Красночикойского районов Забайкальского края: голубика, черника, малина, облепиха, брусника, черная и красная смородина, клубника и земляника. При сборе ягодного сырья учитывалось, что максимальное содержание флавоноидов наблюдается в период полного созревания плодов.
Для первичной оценки содержания флавоноидов в ягодном сырье Забайкальского края были проведены качественные реакции, а именно цианидиновая проба, пробы с хлоридом алюминия, щелочью и хлоридом железа
(III) согласно стандартным методикам. Окраска проб варьировалась в зависимости от примененных методик [3] от светло-розовой до темно-фиолетовой.
Кроме того, методом тонкослойной хроматографии на пластинах «Silufol» было определено содержание антоцианов в исследуемом сырье. Извлечение агликонов антоцианов осуществляли изоамиловым спиртом и путем кислотного гидролиза. Затем проводили хроматографирование. Антоциановые пигменты проявляются на хроматограмме в виде розовых-фиолетовых пятен различной интенсивности. Проведенные исследования позволили сделать вывод о наличии сумм антоциановых комплексов, основными компонентами которых являются – 3-глюкозиды и 3-рутинозиды дельфинидина и цианидина.
Количественное определение проводилось на УФ-спектрофотометре СФ-26 и заключалось в непосредственном измерении оптической плотности, что возможно благодаря наличию сопряженных двойных связей в молекулах антоцианов. Измерение оптической плотности проводили на спектрофотометре при аналитической длине волны от 420 до 620 нм.
Как видно из Рисунка 1 на спектрах
присутствуют пики при длине
волны 520 нм (спектры
для статьи приведены
выборочно). Этот показатель совпадает
с литературными данными и подтверждает результаты качественного анализа. Содержание суммы
антоцианов вычисляли
по формуле:
где Ах – оптическая плотность исследуемого раствора, Сct – концентрация стандартного раствора, W – разведение, Аct – оптическая плотность
стандартного раствора, m – масса навески, V – объем аликвоты. Рассчитанное нами суммарное содержание антоцианов в ягодном
сырье колеблется от 2,25 до 8,51% [5].
Нами также использовался метод ВЭЖХ так как он является
быстрым, хорошо воспроизводимым, требующим малого количества анализируемого вещества. Для ВЭЖХ анализа из всего многообразия флавоноидов
нами выбран дигидрокверцетин (ДГК), так как ДГК превосходит другие флаваноиды по фармакологической активности.
Дигидрокверцетин является
антиоксидантом прямого действия, непосредственно связывающим свободные
радикалы [2]. В этом смысле он является эталонным
продуктом по сравнению со всеми известными, в том числе и синтетическими антиоксидантами прямого действия.
Его эффект существенно превышает уровень действия широко известных
витаминов А, С, Е. Под воздействием дигидрокверцетина свободные радикалы восстанавливаются
в стабильную молекулярную форму, не способную участвовать в цепи аутоокисления (перекисного
окисления липидов), которое
является универсальным механизмом гибели клетки [1].
Для исследований мы использовали базовый раствор стандарта дигидрокверцетина (коммерческий препарат "Капилар"). Первоначально
проводили УФ детекцию при разных длинах волн, добиваясь оптимального результата. Условия проведения анализов: водный стандарт, 10 нг/мкл,
микроинъекция 10 мкл (=100
нг), колонку Chromolith 100 × 4.6 мм, элюент ацетонитрил – 0.05 М, лимонная кислота (14:86,
v/v), 2000 мкл/мин, 44 бара.
После снятия хроматограмм стандарта ДГК была установлена оптимальная длина волны для проведения ВЭЖХ анализа,
она составила 290 нм. Проверку растворимости ДГК проводили на колонке 50 × 4 мм, Ди асфер С18, 5 мкм, УФ 290 нм, 20% водный ацетонитрил, 1000/мин,
46 бар. Растворяли ДГК в системах метанол-вода (50:50), безводный метанол
и вода. Обработка
результатов проходила с помощью компьютерной хроматографической программы "Мультихром".
С целью
разработки методики количественного определения дигидрокверцетина в ягодном
сырье были подобраны оптимальные условия для проведения ВЭЖХ анализа, учтены условия проявления
наибольшей биологической активности ДГК («монокристаллический» ДГК). Далее нами были сняты хроматограммы стандарта ДГК и исходного
ягодного сырья,
некоторые из них представлены на рисунках
2, 3.
Расчеты по количественному содержанию ДГК в исследуемом ягодном сырье приведены
в Табл.1.
Таблица 1
Количественное содержание дигидрокверцетина в ягодном сырье
|
|
tR
|
h,
mV
|
С, мг/г продукта
|
|
Стандарт, 100 нг
|
3.12
|
16.5
|
-
|
|
Красная смородина (Красный Чикой)
|
3.01
|
0.7
|
4.2
|
|
Красная смородина (П-Забайкальский)
|
3.01
|
2.4
|
14.4
|
|
Малина (П-Забайкальский)
|
2.99
|
0.4
|
2,4
|
|
Малина (Красный Чикой)
|
2.99
|
1.0
|
6,0
|
|
Земляника (Красный Чикой)
|
2.99
|
40
|
240,0
|
|
Земляника (П-Забайкальский)
|
2.99
|
27
|
162,0
|
|
Черная смородина (П-Забайкальский)
|
2.97
|
0.3
|
1,8
|
|
Черная смородина (Красный Чикой)
|
2.97
|
0.1
|
0,6
|
|
Черника (Красный Чикой)
|
3.03
|
0.5
|
3,0
|
|
Черника (П-Забайкальский)
|
3.03
|
0.3
|
1,8
|
|
Стандарт, 100 нг
|
2.77
|
17
|
-
|
|
Клубника(П-Забайкальский)
|
2.75
|
16.6
|
98,0
|
|
Облепиха (П-Забайкальский)
|
2.73
|
1.0
|
5,9
|
|
Брусника(П-Забайкальский)
|
2.68
|
1.3
|
7,7
|
Анализ данных ВЭЖХ ягодного
сырья показал, что наибольшее количество дигидрокверцетина наблюдается в землянике и клубнике,
наименьшее в черной смородине, в целом концентрация ДГК в ягодах колеблется от 0,6 до 240 мг/г [4].
Полученные результаты могут быть использованы для создания базы о ягодном сырье Забайкалья, а также для установления подлинности продукции (соков, морсов,
кондитерских изделий и т.д.),
созданной на основе плодов
изученных растений.
Список литературы
1.
ВЭЖХ в контроле
антоцианового состава плодов черной смородины / Л.А. Дайнека, Е.И. Шапошник,
Д.А. Дайнека и др. // Сорбционные и хроматографические процессы. – 2009, Т. 9. Вып. 4. – 529-536 с.
2.
Дигидрокверцетин [электронный ресурс] – URL: http://www.vitalcrystal. ru/assets/files/DGK%20Brochure.pdf (дата обращения: 25.03.2014)
3.
Калинкина Г.И. Методы фармакогностического анализа: учебное
пособие
/
Г.И.
Калинкина, Е.Н. Сальникова [и др.] – Томск: СибГМУ,
– 2008,
– 55 с.
4. Макова А.Ю. Определение флавоноидов в ягодном сырье Забайкальского края методом ВЭЖХ /А.Ю. Макова // XLI Молодежная конференция студентов, аспирантов и магистрантов: Материалы конференции.- Чита,
2014. – Ч. II
5. Рассказова М.В., Макова А.Ю. Определение содержания антоцианов в ягодном сырье различными методами /М.В. Рассказова, А.Ю. Макова // XL Молодежная конференция студентов, аспирантов
и магистрантов: Материалы
конференции. - Чита, 2013. – Ч. I
6. Флавоноиды [электронный ресурс] / «Фитоблог».
– URL: http://phytoblog.ru/2011/07/flavonoidy/ (дата обращения 11.03.14).
