МЕТОДИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕНЕЙ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА

Аннотация: В работе описываются сложности, возникающие при выделении теней эритроцитов из небольшого количества цельной крови (4 мл) человека, а также представлены практические рекомендации по способу их получения.

Ключевые слова: тени эритроцитов, человек

Известно, что мембрана составляет всего 1% от веса эритроцита и особенности ее строения определяют гомеостаз и функциональное состояние клетки [4,5]. В эритроцитарную мембрану включены ферменты пентозофосфатного цикла, гликолиза, адениловой системы, глутатиона и других реакций для реализации анаэробного пути усвоения энергии, также она является важным компонентом антиоксидантной системы организма [5].

Выбор эритроцитов в качестве объекта исследования обусловлен тем, что структура их мембраны отражает общие принципы молекулярной организации плазматических мембран клеток в тканях [1]. Мембраны (тени) эритроцитов человека часто используются для измерения активности таких мембранных переносчиков как Na+/K+-АТфаза, Mg2+-АТФаза, Ca2+/Mg2+-АТФаза и HCО3--АТФаза [2, 5, 11, 12].

При исследовании активности данных ферментов особенно важны целостность мембраны и степень ее очистки, поскольку происходящее при     гемолизе эритроцитов последующее замыкание мембран в везикулярные структуры делает невозможным определение активности АТФаз [2].

У человека тени эритроцитов (рис.1) являются более универсальным объектом для исследования активности ферментов, в отличие от мышечной ткани, поскольку при этом не требуется взятия биопсии.

Основным методом получения теней эритроцитов является метод Доджа и др., 1963 [7], кроме которого существуют другие способы получения теней, также основанные на гипоосмотическом гемолизе эритроцитов [9,10].

К недостаткам данного метода можно отнести следующее:

1.     Выбор промывающего буферного раствора. При изучении мембранных АТФаз, активность которых определяется по приросту неорганического фосфора, следует избегать использования растворов, содержащих соединения фосфора, а также ионы Na+  и К+  (входящие в состав фосфатных буферных растворов), особенно в случае последующего исследования активности Na+/K+-АТФазы.

2.   При указанном в методике [7] режиме центрифугирования (40 мин при 20000 g) с буферными растворами, имеющими рН от 6,8 до 8,0, которые больше соответствуют физиологическим значениям, происходят множественные разрывы мембран эритроцитов. При более мягком режиме центрифугирования (20 мин при 20000 g) авторы [7] предполагают применение более кислого и менее подходящего буферного раствора с рН, равным 5,8.

3.    В используемую гемолизирующую среду исследователи не добавляют вещество, которое бы препятствовало замыканию мембран эритроцитов.

В связи с этим целью настоящего исследования является разработка метода выделения теней эритроцитов человека, полученных из небольшого количества крови (4мл).

Материалы и методы

Кровь брали из вены утром натощак. В качестве антикоагулянта использовали гепарин. Донорами выступали добровольцы (мужчины и женщины) в возрасте 16-26 лет.

Тени эритроцитов получали согласно Должу и др., 1963 [7] в модификации Казенова и др., 1984 [2] из 4 мл крови с дополнительными изменениями, представленными в разделе Результаты.

Результаты

Выделение теней эритроцитов можно условно разделить на следующие этапы.

1                     -й этап - отмывание эритроцитов. Кровь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин, плазму и лейкоциты удаляли. Затем эритроциты трижды промывали 0,145 M раствором NaCl, каждый раз осаждая клетки при 3000 об/мин в течение 10 мин. В модификации Казенова и др. (1984) [2] эритроциты промывали в 0,145 M NaCl в 20 мМ трисНCl буфере, что на практике вызывает гемолиз эритроцитов и делает невозможным проведение последующих этапов.

2                     -й этап - гемолиз эритроцитов. В качестве гемолизирующей среды экспериментальным путем нами был подобран 5 мМ трис-HCl буфер (рН=7.6 при 200С), в который вводили ЭДТА (этилендиаминтетрауксусную кислоту) в концентрации 1 мМ. ЭДТА является хелатором и препятствует замыканию теней эритроцитов в везикулярные структуры. Использование данного реагента в составе гемолизирующей среды является необходимым при исследовании активности АТФаз [2]. Затем один объем отмытых эритроцитов быстро и энергично перемешивали с 20 объемами охлажденной до 40С гемолизирующей среды и выдерживали при данной температуре в течение 5 мин (согласно Казенову и др., 1984 [2]). Все последующие операции также проводили на холоде. Полученный гемолизат центрифугировали в высокоскоростной ультрацентрифуге при 12000 g в течение 20 мин в отличие от способа Казенова и др., 1984 [2], использующих 20000 g, и это, по нашему мнению, препятствует развитию мембранных повреждений.

3                     -й этап - отмывание теней эритроцитов от остаточного гемоглобина. После лизиса эритроцитов надосадочную жидкость удаляли, а осадок теней эритроцитов промывали 5 мМ трис-HCl буфером до исчезновения розового оттенка.

4                     -й этап - хранение теней эритроцитов. Мы выяснили, что замораживание теней эритроцитов при - 400С значительно лучше сохраняет мембраны эритроцитов сроком до 10 дней без включения криопротекторов, чем их хранение при 40С в течение 10 дней. По данным других исследователей тени могут храниться и при 40С не более 7-10 дней [3]. Однако нами установлено, что при таких условиях хранения активность мембранных ферментов (Mg2+- и Na+/K+-АТФаз) существенно уменьшается, что свидетельствует о повреждениях мембраны.

5                     -й этап – подготовка теней к определению активности мембранных ферментов. Для равномерного распределения теней в пробе, например, при исследовании их ферментативной активности желательно использовать перемешивающее устройство Vortex. Для того чтобы в каждую пробу попадало равное количество теней эритроцитов их суспензию мы предлагаем стандартизировать по содержанию белка до определенной аликвоты аналогично другим работам [6, 8].

Обсуждение

Таким образом, отработаны этапы получения теней эритроцитов из малого объема крови (4 мл) человека. Из этого количества венозной крови в среднем удается выделить 0,5 мл концентрированных теней эритроцитов.

В процессе отработки методики было обнаружено, что использование недостаточного количества раствора трис-HCl буфера (менее 10 объемов) не полностью вымывает гемоглобин из мембран эритроцитов и они приобретают розовый оттенок, который не исчезает при последующих центрифугированиях. Повышение концентрации трис-HCl до 20 мМ в буферном растворе, используемом для промывания эритроцитов (заявленное в Казеновом и др., 1984 [2]) и изменение режима центрифугирования, необходимое для осаждения теней, свыше 30-40 мин при более чем 20000g (по Доджу и др., 1963 [7]) способствует сильной фрагментации мембран эритроцитов. Наряду с этим, применяемый нами более мягкий режим центрифугирования (12000 g) лучше сказывается на сохранности мембраны эритроцитов. Время проведения гемолиза клеток, как и в модификации Казенова и др., 1984 [2], не должно превышать 5 мин во избежание появления мембранных разрывов разной степени. В связи с этим один исследователь одновременно может обработать всего до четырех образцов крови, т.к. для процедуры проведения гемолиза эритроцитов требуется дополнительное время на их перемешивание с гемолизирующей средой, помимо времени, затрачиваемое непосредственно на проведение гемолиза.

Таким образом, для корректного определения активности мембранных ферментов эритроцитов необходимо получать их тени с соблюдением всех представленных в работе этапов. В частности, обратить внимание на проведение гемолиза эритроцитов в малом объеме крови, обязательно включать хелатор в состав гемолизирующей среды, чтобы предотвратить замыкание теней, а также выбирать более мягкий режим центрифугирования (12000g) во избежание сильной фрагментации мембран. Разработанная модификация метода позволяет выделять тени эритроцитов из малого количества крови для последующего анализа активности мембранных ферментов.

Список литературы

1.   Боровская М.К., Кузнецова Э.Э., Горохова В.Г., Корякина Л.Б., Курильская Т.Е. Пивоваров Ю.И. Структурно-функциональная характеристика мембраны эритроцита и ее изменения при патологии разного генеза // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2010. № 3. Вып.73. С. 334-354.

2.    Казенов А.М., Маслова М.Н., Шалабодов А.Д. Исследование активности Na/K-АТФазы в эритроцитах млекопитающих // Биохимия. 1984. Т.49 (вып.7). С. 1089-1095.

3. Лишко В.К., Малышева М.К., Гревизирская Т.И. Изучение взаимодействия Na/K-АТФазы мембран и теней эритроцитов с оуабаином // Биохимия. 1974. Т.39. № 1. С.60-66.

4.    Сюсин И.В. Влияние ионов Са2+ на фосфолипидный состав, состояние и морфологические характеристики эритроцитов: Дис. … к-та биол. наук. Саранск. 2015. 123с.

5.   Трошкина Н.А., Циркин В.И., Дворянский С.А. Эритроцит: строение и функции его мембраны // Вятский медицинский вестник. 2007. № 2-3. С. 32-40.

6.    Bartolommei G, Moncelli MR, Tadini-Buoninsegni F. A method to measure hydrolytic activity of adenosinetriphosphatases (ATPases) // PLoS One. 2013. Vol. 8, № 3. e58615.

7. Dodge J., Mitchell C., Hanahan D. The preparation and chemical characteristics of hemoglobin-free ghosts of human erythrocytes // Arch. Biochem. Biophys. 1963. Vol.100, № 1. P. 119-130.

8.    Decreased Erythrocyte Na/K-ATPase Activity and Increased Plasma TBARS in Prehypertensive Patients / Malfatti C.R., Burgos L.Т, Rieger A, Rudger C.L, Turmina J.A., Pereira R.A., Pavlak J.L., Silva L.A., Osiecki R. // Sci. World J. 2012. Article ID 348246, 5 pages doi:10.1100/2012/348246.

9.   Bilezikian J.P., Spiegel A.M., Brown E.M., Aurbach G.D. Identification and persistence of 6-adrenergic receptors during maturation of the rat reticulocyte // Mol. Pharmacol. 1977. Vol. 13, № 5. P. 775-785.

10.   Loss of Beta-Adrenergic Receptor-Guanine Nucleotide Regulatory Protein Interactions Accompanies Decline in Catecholamine Responsiveness of Adenylate Cyclase in Maturing Rat Erythrocytes / Limbird L. E., Gill M., Stadel J.M. Hickey A.R., Lefkowit R.J. // J. Biol. Chem. 1980.Vol.255, № 5. P. 1854-1861.

11. PMCA activity and membrane tubulin affect deformability of erythrocytes from normal and hypertensive human subjects / Monesterolo N.E., Nigra A.D., Campetelli A.N., Santander V.S., Rivelli J.F., Arce C.A., Casale C.H. // Biochim. Biophys. Acta. 2015. Vol. 1848, № 11. P. 2813-2820.

12. The modulation of erythrocyte Na+/K+-ATPase activity by curcumin / Singh P., Kesharwani R.K., Misra K., Rizvi S.I. // J. Adv. Res. 2015.Vol. 6, №6. P. 1023–1030.