24 апреля 2016г.
Сальмонеллы – лактозонегативные грамотрицательные палочки удлиненной формы, с закругленными концами длиной 1…4 и шириной 0,3…0,8 мкм. Подавляющее большинство представителей рода Salmonella подвижны (за исключением S. Gallinarum–Pullorum), органами их движения являются 4-5 жгутиков, расположенных равномерно по всей поверхности микробной клетки. Их длина варьируется от 5 до 10 мкм, диаметр равен 2 мкм. На жгутиках имеются сенсорные белки способные воспринимать плотность окружающей среды, температуру и концентрацию химических веществ. Нить жгутика образована белком – флагеллином (обладает антигенными свойствами), содержание которого может достигать 2 % от массы бактерии. Спор и капсул не образуют (некоторые виды имеют микрокапсулу) [3, 5, 13, 15, 21, 26].
Электронно-микроскопическими методами установлено, что клеточная стенка грамотрицательных бактерий имеет извилистый профиль и 6-слойную структуру. Наружный слой клеточной стенки толщиной 2—4 нм содержит в основном липопротеиды и рыхло связан с подлежащим слоем. Далее расположен пластичный слой, представленный 3-слойной мембраной, имеющей асимметричное строение: ее наружный (осмиофильный) слой толще (4,5—5,5 нм) внутреннего (2,5 нм) электронно-плотного слоя. Между ними расположен менее плотный средний слой. Пластичный слой образован комплексом липополисахаридов (ЛПС) и белков. Липопротеидный комплекс образует 5-й слой, названный глобулярным. Этот слой ковалентно связан с 6-м слоем — пептидогликаном [19, 20]. Внешняя мембрана (первые 5 слоев) содержит 7х105 молекул липида, 1,3х106 молекул белка и 0,7х105 единиц ЛПС на одну клетку.
Липиды внешней мембраны представлены в основном фосфолипидами: фосфатидилэтаноламином (85%), фосфатидилглицерином и дифосфатидилглицерином. В состав липидов входят насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты с разветвленной цепью из 16—18 атомов углерода, что является характерным признаком для грамотрицательных микробов и используется для их таксономии.
Белки внешней мембраны (порины) состоят из основных (4—5) и минорных (8—19) компонентов с различной молекулярной массой. Их функция - пронизывание клеточной стенки микробов и создание пор для диффузии химических соединений через мембрану в клетку [14]. В клетке обнаружено 1,1х105 молекул матриксных белков и 7,2х105 молекул белка липопротеида.
Липопротеид считается основным компонентом внешней мембраны. В клеточной стенке он находится в 2 формах: свободной (2,4х105 молекул на клетку) и связанной с пептидогликаном (4,8х105 молекул). Липопротеид состоит из 58 аминокислотных остатков. С помощью Е-аминогруппы С-терминального лизина полипептид связан с карбоксильной группой каждого 10—12-го остатка диаминопимелиновой кислоты пептидогликана, а с N-конца через цистеин к полипептиду присоединен диглицеридный остаток, который имеет фосфолипидное происхождение. N-терминальный конец липопротеида представлен глицерилцистеином с двумя эфиро- и одной амидосвязанной жирной кислотой. Последние являются мононенасыщенными и на 65% состоят из пальмитата. Пептидная часть липопротеида представляет конформационно α – спираль. Полагают, что 6 молекул таких спиралей формируют суперспираль, которая в комплексе с матриксными белками формирует каналы – поры для пас- сивной диффузии химических соединений через мембрану.
В формировании клеточной стенки энтеробактерий большую роль играет комплекс ЛПС, определяющий в отличие от белков антигенную специфичность клетки. Большая часть ЛПС локализована во внешней мембране и лишь незначительная ее часть обнаруживается за пределами последней в виде О-специфических боковых цепей полисахарида, ЛПС содержит липиды и карбогидрат, к которому присоединены детерминантные группы сахаров. Во внешней мембране молекулы ЛПС через двухвалентные катионы связаны друг с другом, а через гидрофобные и ионные взаимодействия — с фосфатными группами фосфолипидов и основными аминокислотами белков. Это обеспечивает большую подвижность липидов и ЛПС в мембране [8, 18].
Последний, 6-й, слой микробной клетки — пептидогликан (муреиновый или мукопептидный слой). Муреин, составляющий гликановый остов пептидогликана, представлен повторяющимися единицами N- ацетилглюкамина и N-ацетилмурановой кислоты, связанной Д-аланином. Его пептидная часть кроме Д-аланина содержит тетрапептиды, состоящие из L-аланина, D-изоглутаминовой кислоты, L-лизина или диаминопимелиновой кислоты. Кроме того, с помощью химического анализа установлено, что муреиновый слой энтеробактерий содержит липопротеидные молекулы. Цитоплазматическая мембрана состоит из гидрофобной зоны фосфолипидов, которую пронизывают белковые тяжи. Структурные белки мембраны встроены в двойной фосфолипидный слой. Остальные белковые компоненты соединяются гидрофобными связями либо с внешней, либо с внутренней стороной мембраны. Между пептидогликаном внешней мембраны и цитоплазматической мембраной располагается периплазматическое пространство, в котором аккумулируются периплазматические белки. Большая часть их представлена гидролазами (щелочная и кислая фосфатазы, фосфодиэстераза циклического аденозинмонофосфата, пенициллиназа и др.). Другую часть представляют белки, включенные в активный транспорт (связывающие белки). Часть из них расположена свободно (связывающие лейцин, аргинин, сульфат, галактозу), а часть соединена с внешней стороной цитоплазматической мембраны (белки, транспорти- рующие лактозу, пролин, фосфотрансферазу II) [8, 11].
На внутренней стороне мембраны синтезируются основные химические единицы муреина, липополисахарида, фосфолипиды, белки. Всего в цитоплазматической мембране обнаружено около 120 белков. На мембране фиксируются плазмиды – клеточные структуры, способные к автономной репликации без физического сцепления с бактериальной хромосомой. Цитоплазматическая мембрана ответственна за перенос электронов, активный транспорт химических соединений, синтез и перенос предшественников липидов, необходимых для построения клеточной стенки, синтез и перенос белков в периплазматическое пространство [4, 8].
Сальмонеллы являются аэробами и факультативными анаэробами. Оптимальной для размножения S. enterica температурой является 35-37°С, но она (за исключением некоторых сероваров, например, S. Dublin, S. Senftenberg 775W) хорошо растет и при более высокой температуре [23, 25]. Поэтому при бактериологическом исследовании в селективных целях часть посевов культивируют при 43°С. Минимальные температуры, при которых зафиксирован рост сальмонелл, составляют 5,2°С и 6,7°С [10, 22].
Бактерия может расти в широком диапазоне рН (от 4,1 до 9,0), но оптимальной является нейтральная среда. При более низкой температуре (20 °C) или более высокой (42 °C) и при более кислой или более щелочной реакции среды (pH от 4,1 до 9,0) они способны размножаться, но значительно медленнее, чем при оптимальных условиях. При температуре ниже 5 °C их рост полностью прекращается. Высокая концентрация (8% и выше) в среде солей и сахаров ограничивает ее рост [6, 9].
Сальмонеллы отлично растут на универсальных питательных средах (МПА, МПБ, средах Эндо, Левина, Плоскирева, висмут-сульфит агаре и др.), за исключением нескольких сероваров (S. Paratyphi A, S. Choleraesuis, S. Typhisuis, S. Sendai, S. Gallinarum и некоторых других). На плотный средах они формируют небольшие (диаметром 2-4 мм), в типичных случаях гладкие, блестящие, гомогенные колонии (S-форму) [6, 9]. На МПА образуют небольшие, диаметром 1…2 мм, круглые колонии с ровными краями, серо – белого цвета с голубоватым оттенком. У некоторых видов сальмонелл по краю колонии заметен выпуклый слизистый вал. На среде Эндо колонии прозрачные, бледно – розового цвета, на среде Левина – прозрачные с голубоватым оттенком, на среде Плоскирева – бесцветные, слегка мутноватые, на висмут-сульфит агаре – черного цвета с металлическим блеском [5]. На среде П-65 – оливковые, на энтеритном агаре Гектоена – черные, синие или сине- зеленыс с черным центром, на ксилозо-лизин-дезоксихолатном агаре (ХLD)-розовые с/без черным центром, а на среде Вильсона-Блера у разных сероваров цвет вариабельный – от черной с металлическим блеском до светло- зеленого. Нетипичные колонии микроорганизма отличаются от описанных выше. Например, на энтеритном агаре Гектоена и ксилозо-лизин-дезоксихолатном агаре вырастают желтые с/без черным центром колонии, а на среде Вильсона-Блера они часто окрашены в зеленый цвет и окружены зоной помутневшей среды.
Мутантные шероховатая (R) и переходная (SR) формы на плотных средах растут в виде тусклых, сухих, шероховатых колоний неправильной формы с неровными краями [9]. Меньшенин В.В. и др. (2010) предлагают использовать питательную среду, в основу которой заложен гидролизат форменных элементов крови с содержанием аминного азота 700…900 мг%. В состав данной среды входит разведенный в 3 – 4 раза гидролизат (до концентрации аминного азота 150…180 мг%), глюкоза (1 %), однозамещенный фосфорнокислый калий (1 г/л), двузамещенный фосфорнокислый натрий безводный (8,5 г/л), сернокислый аммоний (1 г/л), лимоннокислое железо (50 мг/л), сернокислый магний (100 мг/л), лимоннокислый натрий (100 мг/л). Проведенные Меньшениным В.В. и др. исследования показали, что данная питательная среда не уступает по своим свойствам классическому перевару Хоттингера [7].
На бульонных средах S-форма дает равномерное помутнение, а рост на них R- и SR-форм сопровождается выпадением осадка серовато-белого цвета [9]. В МПБ – слабое помутнение, на дне пробирки осадок серо – белого цвета, на поверхности среды в старых культурах иногда тонкая пленка или пристеночное кольцо [5].
Сальмонеллы обладают следующими биохимическими свойствами: D-глюкозу ферментируют с образованием кислоты и газа. (S. Typhi газа не образуют); ферментируют рамнозу, ксилозу, арабинозу, мальтозу, дульцит, сорбит, трегалозу, маннит. Сальмонеллы – оксидазонегативные, каталазопозитивные, индол и Фогес- Проскауэр (VP) негативные, метиловый красный и цитрат позитивные, продуцируют сероводород и не расщепляют мочевину [6].
Сальмонеллы обладают сравнительно высокой степенью устойчивости к воздействию различных факторов внешней среды. В жидкой среде при прогревании до 70 °C они погибают через 5 – 10 минут, а при кипячении моментально. В замороженном мясе – от 6 мес до 3 лет, в колбасных изделиях – от 60 до 130 суток, в скорлупе яиц – до 3 мес, в яичном порошке – до 9 мес, на замороженных овощах и фруктах – от 2 нед до 2,5 мес. При воздействии прямых солнечных лучей погибают через 5…9 ч. Дезинфицирующие вещества (2%-й раствор фенола, 3%-й раствор гидроксида натрия, хлорсодержащие растворы с 5 % активного хлора, 3%-й раствор формальдегида, жидкий крезол) убивают сальмонелл в течение 15…20 мин [5].
Соление и копчение оказывают на сальмонеллы относительно слабое действие. В соленом мясе они сохраняют жизнеспособность 5— 6 месяцев, а при содержании в продукте 6 – 7% поваренной соли могут даже размножаться. В замороженном мясе сальмонеллы сохраняют жизнеспособность в течение 2—3 лет. Значительной устойчивостью обладают сальмонеллы и к тепловой обработке мяса и других продуктов. Например, некоторые культуры S. Typhimurium погибают в продуктах при 75° через 25 минут, другие выдерживают 85° в течение 40 минут. Повышенная теплоустойчивость сальмонелл в мясе по сравнению со взвесями объясняется тем, что при естественном инфицировании мяса сальмонеллы находятся в нем в тесной биологической связи, а во взвесях и в искусственно инфицированном мясе эти бактерии не так тесно связаны с окружающей средой. Устойчивость сальмонелл к нагреванию в естественно инфицированном фарше намного выше, несмотря на то, что концентрация микробных клеток в этом фарше может быть в несколько раз меньше, чем в искусственно инфицированном [6].
Кроме указанных факторов, теплоустойчивость сальмонелл зависит от вида и серотипа этих микробов, происхождения и возраста культуры, концентрации микробных клеток в субстрате, характера субстрата, в котором сальмонеллы подвергаются нагреванию, условий и техники тепловой обработки, а также от индивидуальных биологических особенностей микробной культуры [2].
Сальмонеллы чувствительны к гентамицину, неомицину, тетрациклинам, левомицетину, стрептомицину, менее чувствительны к сульфаниламидным и нитрофурановым препаратам [5]. Однако, настораживает факт появления штаммов сальмонелл, устойчивых к действию антибиотиков разных групп, что представляет угрозу не только для промышленного животноводства, но и для здоровья людей [1, 12, 16, 17, 24].
Список литературы
1. Афонюшкин, В.Н., Дударева, Е.К., Малахеева, Л.И., Филиппенко, М.Л. Антибиотикорезистентность сальмонелл в Сибири // Ветеринария № 1, 2008. С. 7 – 9.
2. Загаевский, И.С. Справочник по ветеринарно-санитарной экспертизе животноводческой продукции. – К.: Урожай, 1976. – 160 с.
3. Зайнуллин, Л.И. Электрофосфоретические и антигенные свойства полипептидов сальмонелл и идентификация их геномов ПЦР : дис…канд. биол. наук, Казань, 2003. – 157 с.
4. Зарицкий, А.М. Сальмонеллезы. – К.: Здоровье, 1988. – 160 с.
5. Колычев Н.М., Госманов Р.Г. Ветеринарная микробиология и иммунология. – 3-е изд., перераб. и доп. – М.: КолосС, 2003. – 432 с.
6. Лабораторная диагностика сальмонеллезов, обнаружение сальмонелл в пищевых продуктах и объектах окружающей среды: Метод. указания (МУ 4.2.2723–10). – Роспотребнадзор РФ, 2011. – 111 с.
7. Меньшенин, В.В., Школьников, Е.Э., Раевский, А.А. и др. Культивирование вакцинных штаммов сальмонелл с использованием питательных сред из нетрадиционных источников сырья // Достижения науки техники АПК. Теоретический и научно – практический журнал № 8, 2010. С. 65 – 66.
8. Пак, С.Г., Турьянов, М.Х., Пальцев, М.А. Сальмонеллез М.: Медицина, 1988. – 304 с.
9. Шуляк, Б.Ф. Руководство по бактериальным инфекциям собак. Том 2. Грамотрицательные бактерии. – М.: Издательство «ОЛИТА», 2003. – 608 с.
10. Angelotti R., Foter M.J., Lewis K.H. Time-temperature effects on salmonellae and staphylococci in foods. I. Behaviour in refrigerated foods. Amer. J. Publ. Hlth. 1961. Vol. 51. P. 76 – 83.
11. Braun V. Molecular organization of the rigid layer and the cell wall of E. coli. J. Infect. Dis. 1973. Vol. 128, suppl.1. P. 188 – 201.
12. Chiu C.H., Tang P., Chu C., Hu S., Bao Q., Yu J., Chou Y.Y., Wang H.S., Lee Y.S. The genome sequence of
Salmonella enterica serovar Choleraesuis, a highly invasive and resistant zoonotic pathogen. Nucleic Acids Res. 2005. Vol. 33(5). P. 1690-1698. [Электронный ресурс]. Систем. требования: Adobe Acrobat Reader. URL: www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/5781495 (дата обращения: 07.12.2013).
13. D’Aoust J.Y. Salmonella Species. J. Food microbiology. 1997. Vol. 98. P. 223 – 230.
14. Di Rienzo J.M., Nakamura K., Inouye M. The outer membrane of gramnegative bacteria: biosynthesis, assembly, and functions Ann. Rev. Biochem. 1978. Vol. 47. P. 481 – 486.
15. Doyle M.P., Beuchat L.R., Montville T.J. (eds). Food Microbiology. Fundamentals and frontiers. ASM Press, Washington, DC. 1997.
16. Gallardo F., Ruiz J., Marco F., Towner K.J., Vila J. Increase in incidence of resistance to ampicillin, chloramphenicol and trimethoprim in clinical isolates of Salmonella enterica serotype Typhimurium with investigation of molecular epidemiology and mechanisms of resistance. J. Med Microbiol. 1999. Vol. 48. P. 367 – 374.
17. Grob U., Tschape H., Bendarek I., Frosch M. Antibiotic resistance in Salmonella enterica serotype Typhimurium. Eur J. Clin Microbiol Infect Dis. 1998. Vol. 17. P. 385 – 387.
18. Leive L. Functional interrelationship of wall and membranes. The barrier function of the gram-negative envelope.
Ann. N. Y. Acad. Sci. 1974. Vol. 235. P. 101 – 104.
19. Luderitz O., Galanos C., Lehmann V. et al. Lipid A: Chemical structure and biological activity. // J. infect. Dis.1973. Vol. 128. P. 17 – 29. 69
20. Luderitz O., Galanos C., Rietschell E. T. Endotoxins of gram-negative bacteria. // Pharmacol. Ther. 1981. Vol. 15.P. 383 – 402. 70
21. MacNab R.M. In: Neidhardt EC ea (ed.), Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. ASM Press, Washington. 1996. Vol. 1. P. 123–145.
22. Matches J. R., and J. Liston. Effect of pH on low temperature growth of Salmonella. J. Milk Food Technol. 1972.Vol. 35. P. 49–52.
23. Matches J. R., and J. Liston. Low temperature growth of Salmonella. J. Food Sci. 1969. Vol. 33. P. 641–645.
24. Mirelis B., Llovet T., Munoz C., Navarro F., Prats G. Resistance of Salmonella and Campilobacter species to antimicrobial agents. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 1999. Vol. 18. P. 312.
25. Sorqvist S. Heat Resistance in Liquids of Enterococcus spp., Listeria spp., Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Salmonella spp. and Campylobacter spp. Review article Acta vet. Scand. 2003. Vol. 44. P. 1–19.
26. Toguchi A., Siano, M., Burkart, M. & Harshey, R. M. Genetics of swarming motility in Salmonella enterica Serovar Typhimurium: Critical role for lipopolysaccharide. J. Bacteriol. 2000. Vol. 182. P. 6308–6321.
