08 июня 2020г.
ПЦР метод (полимеразной цепной реакции) получил широкое распространение во многих сферах деятельности человека, прежде всего в клинической, криминалистической и судебной медицине, генной инженерии. В настоящее время ПЦР метод активно внедряется и в пищевую промышленность, используется как экспресс-метод получения результатов исследования продуктов питания и кормов для животных на санитарно-показательные, условно-патогенные и патогенные микроорганизмы [4]. В настоящее время в сфере пищевой микробиологии утвержден список методов для подсчета как полезных показателей (количество аэробных колоний), так и гигиенических показателей (Enterobacteriaceae, Escherichiacoli, коагулазо-положительный Staphylococcus), а также для обнаружения четырех основных опасных для жизнедеятельности человека микроорганизмов (Salmonellaspp., Listeriamonocytogenes, E. coli O157 и Campylobacterspp.) [5, 9].
Среди множества различных ПЦР методов, позволяющих проводить исследования с различной селективностью и точностью обнаружения исследуемых показателей особое внимание заслуживает метод ПЦР в режиме реального времени [6, 8].Его активное внедрение в отрасль пищевой промышленности произошло, прежде всего, за счет отказа от электрофоретической детекции, как отдельного этапа исследования, что позволило полностью исключить контаминацию продуктами реакции, сократить трудозатраты и время анализа, снизить строгие требования к организации лабораторного процесса, разместив лабораторию ПЦР в одной комнате, практически «на одном столе».К основным достоинствам данного метода анализа относят: специфичность; универсальность (могут использоваться практически любые материалы); высокую чувствительность (возможность выявлять единичные копии ДНК); малый объем биологического материала (проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы – до нескольких микролитров); высокую скорость получения результата анализа [3], при этом условия обработки продовольственного сырья не влияют на эффективность ПЦР-методов[2]. ПЦР в реальном времени позволяет провести полный анализ пробы в течение 20—60 мин и теоретически способнадетективировать даже одну молекулу ДНК или РНК в пробе.
Помимо снижения трудозатрат и увеличения достоверности результатов, метод обладает целым рядом других важнейших преимуществ, таких как возможность количественной оценки степени обсемененности исходного материала, а также одновременную детекцию нескольких различных микроорганизмов в одном образце - например, параллельное определение содержание Enterobacteriaceae и Salmonellaspp. в образце пищевого продукта.
Метод ПЦР в реальном времени (Real-time PCR)позволяет регистрировать накопление ДНК ПЦР в реальном времени с использованием флуоресценции и количественно оценить ДНК в образце. Для этой цели применяют флуоресцентные метки (флуорофоры) двух видов:
1)Интеркалирующие флуорофоры – соединения, которые встраиваются в любые двух цепочечные молекулы нуклеиновой кислоты и повышают интенсивность флуоресценции. Примерами таких красителей может служить SYBR Green или SYBR Gold.
2) Флуорофоры для меченья олигонуклеотидов – это соединения, интенсивность флуоресценции которых не зависит от связывания с ДНК и регулируется так называемыми гасителями (темновыми или флуоресцирующими). К настоящему времени разработано множество вариантов структуры, меченных парой флуорофор – гаситель олигонуклеотидов: линейные разрушаемые зонды (TaqMan), «Молекулярные маячки» (beacons), примыкающие пробы (Lightcycler).
Расчеты результатов ПЦР в реальном времени достаточно сложны и проводятся в автоматическом режиме с использованием компьютерных программ. Одной из программ для расчета относительного количества ДНК-мишени, находящейся в свободном доступе в сети Интернет, является REST2009. Расчеты основаны на связи интенсивности флуоресцентного сигнала с концентрацией ДНК в пробирке. Сравнивают число циклов амплификации, необходимых для нарастания сигнала флуоресценции в образцах до одной и той же величины. Теоретически концентрация ампликонов при многократном повторении цикла должна возрастать экспоненциально и описывается формулой (1):
Сn = С0 x 2n (1)
где С0 – исходное количество ДНК-мишени, Сn – концентрация ампликонов после «n» циклов. На практике, синтез ампликонов постепенно замедляется по мере истощения компонентов реакционной смеси. Накопление ДНК в ходе ПЦР описывают кривой и делят на четыре стадии: линейная фоновая фаза, стадия раннего экспоненциального роста количества ампликона, стадия линейного логарифмического роста, стадия выхода на плато. На стадии раннего экспоненциального роста эффективность амплификации максимальна в сравнении с другими стадиями. Накопление ДНК в ходе ПЦР описывается формулой (2):
Сn = С0 х (1 + E)n (2)
где Сn – количество продуктов реакции на цикле n; C0 – изначальное количество исследуемой ДНК на первом цикле; Е – эффективность амплификации. Значение Е находится в пределах от 0 до 1, что соответствует удвоению исходного количества ДНК за цикл, а при Е = 0 образование продукта не происходит. Для сравнения данных между образцами используют один из двух методов. В первом, для расчета величины «n» используют значение порогового цикла (Ct – от англ. thresholdcycle) – точки пересечения кривой накопления флуоресценции и одинаковой для всех образцов пороговой линии. Значение Ct определяется автоматически программным обеспечением к прибору или задается вручную в пределах стадии раннего экспоненциального роста накопления флуоресценции. Во втором, используют метод прямого сравнения графиков. Для определения величины «n» на кривой находят точку, положение которой отражает форму кривой (Ср – от англ. crossingpoint). Обычно рассчитывают максимумы первой и второй производных графиков накопления флуоресценции. Значение эффективности амплификации подбирается эмпирически путем последовательных разбавлений образца. Расчеты основаны на связи интенсивности флуоресцентного сигнала с концентрацией ДНК в пробирке.
Процедуру ПЦР-анализа пищевой продукции регламентирует ГОСТ Р ИСО/МЭК-17025 [1].Внедрение в широкую практику методик ПЦР сформировало в 1988 году программу проверки квалификации в области пищевой микробиологии RAEMA (Réseaud'Analysesetd'EchangesenMicrobiologiedesAliments). Это межлабораторное сравнение устанавливает умение выявлять Salmonella и Listeriamonocytogenes, а также подсчет аэробных микроорганизмов, Enterobacteriaceae, кишечной палочки, бета-глюкуронидазы-позитивных бактерий Escherichiacoli, анаэробных сульфитредуцирующих бактерий, Clostridiumperfringens, коагулазоактивных бактерий, коагулазоактивных и коагулацциозных, коагулазоактивных и коагулазоактивных бактерий L. monocytogenes. Два раза в год участникам отправляются пробы по пять единиц для оценки их точности и достоверности при подсчете и обнаружении микроорганизмов. Внутренние программы обеспечения качества также способствуют более широкому использованию средств контроля качества [7].
Список литературы
1. ГОСТ Р 52833-2007 (ИСО 22174:2005). Микробиология пищевой продукции и кормов для животных, метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для определения патогенных микроорганизмов. Общие требования и определения. – М., 2008. – 12 с.
2. Москвина Н.А., Голубцова Ю.В., Кригер О.В. Применение метода полимеразной цепной реакции для видовой идентификации продуктов переработки растительного сырья //Техника и технология пищевых производств. 2014. № 2 – С.126-129
3. Просеков А.Ю., Бабич О.О., Сухих С.А.. Современные методы исследования сырья и биотехнологической продукции /Кемерово, 2013. – 183 с.
4. Соколов Д.М., Соколов М.С. Ускоренные методы выявления бактерий рода Salmonella в пищевых продуктах и сырье // Вопросы питания, 2013. Т.82, №1. С.33-40
5. Технический регламент Таможенного союза "О безопасности пищевой продукции". ТР ТС 021/2011 Утвержден Решением Комиссии Таможенного союза от 09.12.2011г №880
6. A charcoal- and blood-free enrichment broth for isolation and PCR detection of Campylobacter jejuna and Campylobacter coli in chicken. /L.Y. Solis-Soto, S.Garcia, I.Wesley, N.Heredia //J Food Prot., 2011. vol.74. №2.- p.221-227.
7. Augustin J.C., Carlier V.Lessons from the organization of a proficiency testing program in food microbiology by interlaboratory comparison: analytical methods in use, impact of methods on bacterial counts and measurement uncertainty of bacterial counts. //Food Microbiol., 2006 Feb;23(1). р.1-38.
8. Enhanced enrichment and detection of thermotolerant Campylobacter species from water using the Portable Microbe Enrichment Unit and real-time PCR. / T.Pitkanen, J.Bracker, I.T.Miettinen, A.Heitto, J.Pesola, E.Hakalehto // Can J. Microbiol., 2009. vol.55. №7.- p.849-858.
9. Jasson V., Jacxsens L., Luning P., Rajkovic A., Uyttendaele M. Alternative microbial methods: An overview and selection criteria. //Food Microbiol., 2010 Sep;27(6) Р.710-730. doi: 10.1016/j.fm.2010.04.008.
