11 декабря 2015г.
В настоящее время заболеваемость микозами имеет тенденцию к непрерывному росту. Наиболее частыми возбудителями грибковых инфекций являются грибы рода Candida аlbicans. Адгезивные свойства этих грибов определяют колонизацию слизистых оболочек человека, но при наличии иммунной дисфункции они способны вызвать тяжелые системные заболевания, которые приводят к осложнениям и высокой смертности, особенно при нозокомиальных инфекциях. Это связано с полиморфизмом возбудителя. Благодаря наличию гиф-элементов, которые разрушают эпителий, дрожжеподобные клетки проникают в глубь тканей, что имеет важное значение в развитии патогенеза заболевания [7, 8, 11]. Важнейшим фактором патогенности C.albicans, который обеспечивает деструкцию тканей человека, является аспартат протеиназа (САП) [6]. Этот фермент концентрируется на терминальных концах гифов и обеспечивает непосредственную инвазию грибов в ткани человека. Исследователями отмечено, что патогенность C.albicans является мультифактороной, а вирулентность определяется наличием аспартат протеиназ [12]. Итак, возможность нейтрализации аспартат протеиназ может стать эффективным инструментом антивирулентной терапии при кандидозах.
Одним из факторов патогенности C.albicans является способность к формированию биопленок, в которых грибы имеют более выраженную секрецию аспартат протеиназ по сравнению с их планктонными формами. Этот феномен исследователи склонны расценивать как один из механизмов повышения вирулентности кандид в составе биопленок [3].
Факторами патогенности С.albicans также считаются фосфолипазы, кислые протеазы, способность маскировать рецепторы к компонентам комплемента и опсонинам, что снижает эффективность фагоцитарных реакций [4].
Таким образом, актуальным вопросом остается изучение факторов патогенности грибов С.albicans и их роли в развитие инфекционного процесса.
Цель исследования – определение ферментативной активности аспанрагиновой протеиназы, фосфолипазы и протеазы у клинических и референтных штаммов С.albicans.
Материалы и методы. Определение ферментативной активности проводили на 20 штаммах С.albicans выделенных от больных с пневмонией, в качестве контрольной группы использовали референтный штамм С.albicans АТСС 885-653. Для выделения чистой культуры грибов С.albicans использовали среду Сабуро. Ферментативную активность исследовали на смывах суточных агаровых культур.
Каталитическую активность САП C.albicans оценивали по уменьшению концентрации субстрата – гемоглобина (Hb) в присутствии фермента [6, 9, 10]. Для этого измеряли оптическую плотность растворов Hb в присутствии САП C.albicans при λ = 407нм. В контрольном исследовании измеряли оптическую плотность растворов Hb в той же концентрации, но без фермента. Уровень собственного поглощения САП C.albicans в растворе рассчитывали по калибровочному графикому. Введение в раствор Hb протеиназ САП C.albicans приводило к уменьшению величины оптической плотности прλи= 407 нм, соответственно поглощению Hb. В результате ферментативного протеолиза Hb подвергается разрушению до аминокислот или пептидов, что приводит к уменьшению общей концентрации Hb и снижению величины оптической плотности при λ = 407 нм.
При определении фосфолипазной активности C.albicans использовали титрометрический метод в модификаии Суплотова С. Н. [1, 5]. Показатели оценивали в м×мчоалсь /л.
Для изучения протеазной активности использовали биуретового метод, показатели оценивали в мг/мин.×мл [2].
Результаты исследования и их обсуждения. При определении содержания аспарагиновой протеиназы C.albicans были получены следующие результаты. Во всех исследуемых клинических штаммах C.albicans показатели содержания аспарагиновой протеиназы были больше – (3,7×107) ммоль/л, чем у референтных штаммов – (2,5×107) ммоль/л (рис. 1).
Показатели каталитической активности протеиназ были ниже у референтных штаммов и составили – (1,2×108) моль/л×мин. Для клинических изолятов эти показатели составили – (1,7×108) ммоль/л×мин.
В ходе исследования было также изучено активность таких ферментов агрессии как фосфолипаза и протеаза.
Показатели фосфолипазной активности для клинических штаммов составили – (27,3±1,9) ммоль/л×час, для референтных штаммов – (20,1±2,2) ммоль/л×час.
При анализе протеазной активности у клинических изолятов C.albicans определены достоверно более высокие показатели (p≤0,0001), которые составили – (0,37±0,04) мг/мин.×мл, в то время как у референтных штаммов они составили – (0,24±0,05) мг/мин.×мл (Таб. 1).
Рис. 1. Электронные спектры поглощения Hb клинических штаммов C.albicans в концентрации 1×105 моль/л (1).
Электронные спектры поглощения Hb референтных штаммов C.albicans в концентрации 1×105 моль / л (2).
Примечание: * – разница достоверная р<0,05; представлено результаты исследования 3-х повторов.
Выводы
В результате проведеного исследования было установлено, что ферментативная активность выше у клиничесих штаммов C.albicans, чем у референтных, что возможно связано со степенью патогенности первых. Также установлено достоверное увеличение фосфолипазы у клинических штаммов (p≤0,0001). Это может способствовать гидролитическому расцеплению жирных кислот в фосфолипидах и разрушению иммуноглобулинов, тем самым повышая устойчивость C.albicans к кислородозависимому бактерицидному механизму действия фагоцитов. Поэтому в перспективе исследований изучение фагоцитарной активности нейтрофилов относительно штаммов C.albicans.
Список литературы
1. Карпунина Т. И. Фосфолипазы оппортунистических грибов: их возможная роль в патогенезе и диагностике микозов / Т. И. Карпунина, А. А. Олина, М. Г. Машуров // Проблемы медицинской микологии. – 2006. – Т. 8, № 4. – С. 41-46.
2. Практикум по микробиологии / Под ред. А. И. Нетрусова. – М. : Академия, 2005. – 608 с.
3. Сергеев А. Ю. Кандидоз. Природа инфекции, механизмы агрессии и защиты, лабораторная диагностика, клиника и лечение / А. Ю. Сергеев, Ю. В. Сергеев. – М. : Триада-X, 2001. – 472 с.
4. Сергеев А. Ю., Сергеев Ю. В. Факторы резистентности и иммунитет при грибковых инфекциях кожи и слизистых оболочек / А. Ю. Сергеев, Ю. В. Сергеев // Иммунопатология, аллергология, инфектология. – 2004. – № 1. – С. 6-14.
5. Суплотов С. Н. Адаптация человека к авиаполетам. Липопероксидация в эритроцитах и ее регуляция / С. Н. Суплотов, Т. Д. Журавлева Методы лабораторной диагностики. – Тюмень : Печатник, 2009. – 104 с.
6. Факторы патогенности грибов рода Candida / О. В. Голубка, Е. М. Савинова, Г. А. Лошко, И. В. Журавлева // Клінічна та експериментальна патологія.– 2011. – Т. 10, № 4. – С. 109-112.
7. Coogan M. M. Candida and mycotic infections / M. M. Coogan, P. L. Fidel, M. C. Komesu // Adv. Dent. Res. – 2006. – Vol.19, № 1. – P. 130-138.
8. Douglas L. J. Candida biofilms and their role in infection / L. J. Douglas // Trends Microbiol. – 2003. – Vol. 11, № 1. – Р. 30-36.
9. Evidence for degradation of gastrointestinal mucin by Candida albicans secretory aspartyl proteinase / A. R. Colina, F. Aumont, N. Deslauriers et al. // Infect. Immun. – 1996 – Vol. 64, № 11. – Р. 4514-19.
10. Exposure of Candida albicans to antifungal agents affects expression of SAP2 and SAP9 secreted proteinase genes / V. M. Copping, C. J. Barelle, B. Hube et al. // J. Antimic. Chemother. – 2005. – Vol. 55, № 5. – Р. 645-654.
11. Function of Candida albicans adhesion Нwр1 in biofilm formation / С. J. Nobile, J. Е. Nett, D. R. Andes, А. Р. Mitchell // Eukaryot. Сеll. – 2006. – Vol. 5, № 10. – Р. 1604-10.
12. Naglik J. R. Candida albicans secreted aspartyl proteinases in virulence and pathogenesis / J. R. Naglik, S. J. Challacombe, B. Hube // Microbiol. Mol. Biol. Rev. – 2003. – Vol. 67, № 3. – Р. 400-428.
