29 ноября 2015г.
В последнее время в медицине внедряются новые методики терапии с использованием лазеров повышенной мощности, что позволяет достичь терапевтически значимых доз лазерного излучения в глубине ткани [1,3,7]. Представляет большой интерес воздействие лазерного излучения на костный мозг, обеспечивающий за счет стволовых и юных клеток процессы кроветворения и регенерации. Однако, сведения о действии лазерного излучения на структуры костного мозга единичны и касаются эффектов низкоинтенсивных режимов, преимущественно гелий-неонового лазера [3,7].
Регуляция процессов созревания, дифференциации и миграции клеток костного мозга осуществляется с активным участием его стромы. Клетки микроокружения регулируют адгезивные возможности, ангиогенез, активность ферментов, факторов роста и цитокинов, участвующих в мобилизации клеток из костного мозга в периферический кровоток [1,2,4]. В доступной литературе имеются лишь разрозненные сведения о реакции клеток глубоколежащих тканей, в том числе и костного мозга, в ответ на лазерное облучение, проводимое с поверхности кожи. Оценка активности желатиназ, ферментов группы матриксных металлопротеиназ, является важной составляющей комплекса реакций, определяющих миграционные возможности гемопоэтических клеток.
Целью исследования являлось изучение активности желатиназ костного мозга после лазерного воздействия с различной длиной волны.
Материалы и методы. Эксперименты проводились на 50 беспородных половозрелых крысах, содержавшихся в условиях вивария. Каждая группа экспериментальных животных состояла из 10 особей. В качестве источника лазерного излучения использовали диодные лазеры ―ALTO‖ (Израиль) с длиной волны излучения 980 нм и «Милон» (Россия) с длиной волны 660 нм. Доставку излучения осуществляли через моноволоконный световод диаметром 600 мкм. Животным производилось облучение левого бедра мощностью 2 Вт в течение 2 минут бесконтактно в сканирующем режиме.
Суммарная активность желатиназ оценивалась методом прямой зимографии по Tyagi S. Гомогенат костного мозга в буфере (рН 6,8) наносили пробами по 10 мкл на предварительно подготовленный гель агарозы 1% (ICN) на кальциевом буфере (20 mM CaCl2; 150 mM NaCl; 50mM Tris-Cl, pH 7,4) с добавлением 0,2% желатина. Затем гели инкубировали в при температуре 37С в течение 16 часов, фиксировали уксусной кислотой и окрашивали 0,1% Coomassie Brilliant Blue R-250. Окрашенные зимограммы сканировали, на изображении определяли оптическую плотность области лизиса с помощью программы анализа изображений
«ДиаМорф Cito_W».
Статистическая обработка материала была проведена с помощью пакета прикладных программ Statistica
6.1 (StatSoft Inc, США) методами непараметрической статистики. Количественные данные представлены в формате Me(UQ-LQ) - медиана, верхний и нижний квартили. Сравнение данных производились путем вычисления U-критерия Манна-Уитни.
Результаты.
Активность желатиназ (матриксных металлопротеиназ 2 и 9) изучалась методом прямой зимографии. Данный метод является полуколичественным и может свидетельствовать лишь о сравнительном изменении зимолитической активности. Полученные пятна лизиса совпадали по площади с размером нанесенной пробы и слабо различались по оптической плотности визуально. Поэтому для анализа полученных данных была использована компьютерная программа анализа изображений «ДиаМорф Cito_W». В качестве характеристики активности матриксных металлопротеиназ была выбрана средняя оптическая плотность области лизиса, соответственно, чем ниже был показатель оптической плотности, тем выше активность металлопротеиназ.
Оптическая плотность областей лизиса в контроле составила 20,1(18,5;22,6) у.е. Через 1 час после воздействия области лизиса на зимограммах для облученных конечностей имели достоверно меньшую оптическую плотность, чем области лизиса необлученных конечностей. Для лазера 660 нм оптическая плотность составила в необлученной конечности 27,4(25,4;30,9) у.е. против 21,9(17,03;25,4) у.е. в облученной, для лазера 980нм в необлученной конечности 24,2(23,2;25,4) у.е. против 18,7(16,4;23,2) у.е. в облученной, (p<0,01). По сравнению с контролем в облученном костном мозге оптическая плотность также достоверно снижалась, что свидетельствует об увеличении активности желатиназ. Активность желатиназ в костном мозге необлученных конечностей достоверно не отличалась от контроля. Активность металлопротеиназ конечностей, облученных разными длинами волн, статистически не различалась.
Через сутки после воздействия активность исследуемых протеиназ в конечностях, подвергшихся воздействию, была достоверно ниже, чем в необлученных. Соответственно, оптическая плотность составила для лазера 660 нм в облученной конечности 16,9(14,2;20,0) у.е. против 22,7(20,5;25,5) у.е. в необлученной, для лазера 980 нм в облученной конечности 16,5(12,6;18,7) у.е. против 21,4(14,6;25,4) у.е. в необлученной, и была достоверно ниже, чем в контроле (p<0,01). Активность желатиназ в костном мозе необлученных конечностей достоверно не отличалась от контроля. Картина была одинаковой для обеих длин волн, использованных в исследовании.
Активность металлопротеиназ в костном мозге конечностей, облученных разными длинами волн, статистически не отличалась.
Статистический анализ показал, что оптическая плотность областей лизиса для конечностей, не подвергшихся непосредственному лазерному воздействию (необлученные конечности на сроках 1 час и 1 сутки, и контроль) статистически не отличаются друг от друга (p=0,234)
Отмеченная динамика активности желатиназ в ответ на однократное лазерное воздействие, свидетельствует о значительном влиянии лазерного излучения на костный мозг при накожном применении. Используемые плотности мощности оказались достаточными для ранней активации реакции ферментов. Известно, что лазерное воздействие на ткани активирует сложный каскад клеточных реакций, вызывающих перестройку структур и адгезивных взаимодействий, в итоге на уровне костного мозга может происходить ослабление связи стволовых клеток с клетками стромы и межклеточным матриксом [1,5]. Источниками протеолитических ферментов могут являться все способные к миграции клетки: непосредственно тучные клетки, нейтрофилы, макрофаги или стволовые клетки. При этом важную роль в активизации не активных форм матриксных металлопротеиназ играет химаза тучных клеток, дегранулирующих при лазерном воздействии [4,6,8]. Таким образом, кратковременная активация ферментов лазерным воздействием является базой для увеличения миграционных возможностей клеток костного мозга. На этой основе нами разрабатываются способы повышения содержания стволовых клеток в крови, которые могут применяться в регенеративной медицине.
Список литературы
1. Головнева Е.С. Динамика уровня основного фактора роста фибробластов в процессе неоангиогенеза, стимулированного воздействием высокоинтенсивного лазерного излучения // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.2002.Т.134.№7.С.109-111.
2. Климин В.Г., Фурса Т.О., Юшков Б.Г. Тучные клетки и регуляция микроциркуляции в костном мозге // Вестник Уральской медицинской академической науки – 2004. – №1. – С.42-46.
3. Кравченко Т.Г., Зарезина А.В. Головнева Е.С. Оценка глубины проникновения лазерного излучения при терапевтическом воздействии методом компьютерного моделирования // Вестник новых медицинских технологий. – 2007. –№ 2. – С. 202-204.
4. Юшков Б.Г., Климин В.Г., Кузьмин А.И. Сосуды костного мозга и регуляция кроветворения. – Екатеринбург: УроРАН. – 2004. – 150с.
5. Abel M., Vliagoftis H. Mast cell-fibroblast interactions induce matrix metalloproteinase-9 release from fibroblasts: role for IgE-mediated mast cell activation // J Immunol. – 2008. – Vol.180. – P.3543-3550.
6. Klein G., Schmal O., Aicher W.K. Matrix metalloproteinases in stem cell mobilization//Matrix Biol. 2015 Jan 21. pii: S0945-053X(15)00025-6. doi: 10.1016/j.matbio.2015.01.011
7. Lappa A.V., Kazakov A.A., Veresov S.I. et.al. Contact thermometry in intensive fields of laser radiation // Proceedings of SPIE - The International Society for Optical Engineering Proceedings of the 1998 Thermal Therapy, Laser Welding, and Tissue Interaction. sponsors: EOS, SPIE, ELA, SSL. Stockholm, SWE, 1999. С. 90- 100.
8. Winkler I.G., Levesque J.P. Mechanisms of hematopoietic stem cell mobilization: when innate immunity assails the cells that make blood and bone.// Exp. Hematol. -2006. -34(8).-P.996-1009.
