Единственным и полноценным кормом для гусениц тутового шелкопряда является лист шелковицы. Кормовая база тутового шелкопряда в современных условиях – это специальные плантации шелковицы с определенной схемой посадки и типом формовки в соответствии с направлениями их использования. Для успешного развития шелководства необходима высокопродуктивная кормовая база, что предусматривает наличие технологичных, экономически эффективных плантаций шелковицы, постоянно  восполняющихся новыми высокоурожайными болезнеустойчивыми растениями [1].

Размножение шелковицы в промышленных масштабах традиционным путем весьма затратно. Поэтому все большее значение приобретает использование для этих целей микроклонального размножения in vitro [2]. В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки – давать начало целому растительному организму [3].

Микроклональное размножения in vitro позволяет получать: оздоровленный материал в больших количествах, планировать выпуск растений к определенному сроку, длительно хранить пробирочные растения и создавать «банк» ценных форм и сортов [4]. Поэтому микроразмножение может стать перспективным направлением восполнения кормовой базы тутового шелкопряда и обеспечения саженцами шелковицы в промышленных масштабах.

В ФГБНУ «Научно-исследовательская станция шелководства» изучением, сохранением и улучшением кормовой базы тутового шелкопряда занимаются с 70-х годов прошлого века, но размножение кормовой шелковицы проводилось традиционными методами. В связи с перспективностью микроразмножения in vitro для ускоренного расширения и улучшения сортимента кормовой шелковицы, исследования в последнее время направлены на изучение особенностей микроклонального размножения полиплоидных сортов шелковицы российской селекции.

Для наших исследований были отобраны вызревшие однолетние побеги со здоровой верхушечной почкой 2-х полиплоидных сортов шелковицы российской селекции: ПС-109,4п (тетраплоид) и Надежда (триплоид), произрастающие на кормовой плантации ФГБНУ Шелкстанция. Испытуемые высокопродуктивные сорта, имеют сложное видовое происхождение: Надежда ([Morus multicaulus х Morus alba] х Morus bombycis) и ПС-109,4п ([Morus alba х Morus Kagayamae] х Morus alba). Данные сорта традиционным путем вегетативно трудноразмножаемые. Побеги для микроразмножения были взяты с деревьев 10-летнего возраста в 2 срока: март и август. Срезанные побеги промывали в проточной воде, дезинфицировали в 96% этиловом спирте в течение 30 секунд, далее в 5% растворе гипохлорита кальция в течение 8 минут, затем промывали дистиллированной водой. С подготовленных побегов срезали верхушечные почки с частью побега длиной 0,3см (эксплантат). Для опыта от каждого сорта было взято по 60 почек. Отобранные и подготовленные эксплантаты были вертикально помещены в питательную среду. Питательная среда контрольного варианта (базовая) Мурасиге-Скуга (MС) с добавлением 30г/л сахарозы и 7г/л агар-агара. Уровень pH среды перед застудневанием агар-агаром – 5.8. В опытных вариантах к базовой питательной среде были добавлены 500мг аскорбиновой кислоты, 1,5мг/л 6- бензиламинопурина (6-БАП) и 0,3мг/л 2.4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2.4-Д). После раскрытия почек, появившиеся микропобеги пассировались каждые 45 дней в той же питательной среде. Для стимулирования роста адвентивных побегов после второго пассажа микропобеги были высажены в питательную среду, следующего состава: MС с добавлением 0,5мг/л α-нафтилуксусной кислоты (НУК). Для стимулирования образования корней у побегов была использована следующая питательная среда: MС с добавлением 1,0мг/л индол-3-масляной кислоты (ИМК). Исследуемые образцы культуры содержались при температуре +27˚С под светом флуоресцентной лампы с 16ч фотопериодом. Для сравнения 2-х питательных сред были сформированы следующие варианты 1,3,5,7 как базовые, 2,4,6, и 8 как опытные. Сравнение проводили между сортами: варианты 1,2,5,6 для сорта Надежда, 3,4,7,8 – для сорта ПС-109,4п, а также между сезонами высадки эксплантатов: варианты 1-4 – март, варианты 5-8 – август. Наблюдения за образцами фиксировались каждый 7 дней в течение 4-х месяцев с расчетом процентного выхода раскрывшихся почек для 2-х периодов высаживания. Через 4 месяца культивирования проводили подсчет и измерение длинны основного (центрального) и придаточных микропобегов. Наблюдение за образованием корней у опытных образцов проводили только в 1-4 вариантах (мартовская высадка). Исследования проводились в лабораторных помещениях Шелкстанции по общепринятой методике.

В результате проделанной работы были получены следующие результаты: погруженные в питательную среду срезанные почки (эксплантаты) испытуемых сортов начали раскрываться в марте на 6-9 день после высаживания. 100%-ный выход раскрывшихся почек имели эксплантаты триплоидного сорта Надежда в весенний период вегетации в опытной среде (вариант 4). в базовой среде (контроль) раскрывшихся почек было на 19,6% меньше. В образцах тетраплоидного сорта ПС-109,4п высокий результат наблюдался в аналогичной питательной среде (93,5%), при этом в базовой – развитие получили лишь 61,1% эксплантатов. Однако в августовский период наблюдений (5-8 варианты), независимо от состава питательных сред и генотипа исследуемых сортов, почек раскрылось меньше на 13,4-57,4%, наименьшая разница в опытном варианте у образцов триплоидного сорта Надежда (Табл.1).

Таблица 1  

Характеристика сортов шелковицы по раскрытию почек при микроразмножении in vitro

Вариант	Сорт	Состав питательной среды	Периоды высаживания эксплантата	Количество дней до раскрытия почки	Выход раскрывшихся почек, %
1	Надежда	базовый	март	7	80,4±5,17
2		опытный		6	100,0 ±1,25
3	ПС-109, 4п	базовый		9	61,1 ± 7,22
4		опытный		8	93,5 ± 2,31
5	Надежда	базовый	август	8	64,9 ±1,04
6		опытный		7	86,6 ± 1,31
7	ПС-109, 4п	базовый		9	42,6 ± 2,12
8		опытный		7	75,7 ± 1,36

 

Из Табл.1 видно, что развитие почек при размножении in vitro зависит не только от периода высаживания образцов, состава питательной среды, но и от сорта, что указывает на связь сезона раскрытия почек шелковицы в условиях in vitro с генетической предрасположенностью и комбинацией фитогормонов. Это подтверждается высказыванием некоторых авторов, что реакция на микроразмножение in vitro шелковицы зависит от генотипа и сезона [2].

На 2-м этапе работы, когда проросшие почки были пересажены из чашек Петри в пробирки, в период первого пассажа появились микропобеги, из которых определяли основной (центральный) и несколько придаточных. Центральный микропобег у сорта Надежда был длиннее, чем у сорта ПС-109,4п (1,9 и 0,9 см, соответственно). В дальнейших наблюдениях было отмечено, что независимо от количества пассажей, как центральный, так и придаточные микропобеги у сорта Надежда были длиннее, чем у сорта ПС-109,4п на 0,7 и 0,1см соответственно. Также следует отметить закономерность между двумя пассажами: после первой пересадки количество придаточных микропобегов сократилось у обоих сортов относительно срока высадки, что указывает на зависимость реакции на микроразмножение от сезона и, возможно, от генотипа (Табл.2).

Таблица 2  

Характеристика микропобегов при размножении in vitro.

Сорт	Состав питательной среды	Срок высадки экспланта	Длина центрального микропобега, мм	Длина придаточного микропобега, мм	Количество придаточных микропобегов, шт.
Надежда	базовый	март	1,1±0,12	0,5±0,07	3,7±0,14
	опытный		1,9±0,33	1,0±0,04	5,2±0,45
	базовый	август	0,6±0,24	0,4±0,16	3,0±0,19

	опытный		1,1±0,12	0,5±0,31	4,2±0,27
ПС-109, 4п	базовый	март	0,6±0,22	0,4±0,11	2,1±0,28
	опытный		0,9±0,20	0,7±0,15	3,1±0,16
	базовый	август	0,2±0,22	0,1±0,10	1,9±0,20
	опытный		0,4±0,11	0,3±0,26	2,8±0,23

 

Наблюдение за корнеобразованием проводилось только в мартовский период эксперимента (Табл.3).

Таблица 3

Показатели по укоренению микропобегов шелковицы в весенний период

Сорт	Состав питательной среды	Количество основных корней, шт.	Количество придаточных корней, шт.	Средняя длина корня, см	Выход корней, %
Надежда	базовый	1,3 ± 0,5	8,2 ± 0,9	3,2 ± 1,1	53,1 ± 2,1
	опытный	1,8 ± 0,7	9,1 ±1,1	5,9 ± 1,0	87,4 ± 2,5
Пс-109,4п	базовый	1,0 ± 0,8	5,9 ± 1,3	2,2 ± 1,4	46,5 ± 2,9
	опытный	1,4 ± 0,6	7,3 ± 1,4	4,6 ±0,8	72,7 ± 1,6

Образование и рост корней были достигнуты с помощью разрастания базальной части микропобегов, при этом наблюдалась разница в их развитии между сортами и составом питательной среды: показатели по триплоидному сорту Надежда как по выходу, так и по средней длине корня выше, чем у тетраплоидного сорта Пс-109,4п, наша модификация базовой среды, также дала положительный результат.

Таким образом, результаты наших исследований подтверждают преимущество триплоидных сортов при микроклонировании шелковицы независимо от сезона их размножения и состава питательной среды.

Следует отметить, что использование микроразмножения in vitro для решения проблемы промышленного тиражирования шелковицы имеет свои особенности, в основном связанные с возможностями морфогенетического потенциала сортов шелковицы, сезоном высадки, а также с подбором оптимальной питательной среды.

 

Список литературы

1.     Богословский В.В., Лейнвебер Е.Ф., Селионова М.И. Биологические и продуктивные особенности разноплоидных сортов кормовой шелковицы и их использование для разносезонных выкормок тутового шелкопряда // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. 2011. № 1. С. 54-57.

2.     Бартиш И.В. Разработка метода органогенеза из мезофильной ткани для некоторых сортов и клоновых подвоев яблони // Тез. докл. II Российского симпозиума «Новые методы биотехнологии растений». – Пущино. 1993. С.116.

3.     Бурдасов В.М., Ильина Е.И., Коннова Н.В. Особенности микроклонального размножения яблони // V Междунар. конф. «Биология культивируемых клеток и биотехнология»: Тез докл. – Новосибирск. 1988. С. 360.

4.     Короховой В.И., Бартиш И.В., Состав культуральной среды и эффективность образования побегов in vitro из листовых эксплантов яблони // Физиология растений. 1997. №3. С. 440-444.

5.     Тарашвили З.Т., Высоцкий В. А. Микроразмножение здорового посадочного материала ягодных культур // Садоводство. 1982. №2. С.22-23.