ОПРЕДЕЛЕНИЕ О-(2,3-ДИГИДРО-2,2-ДИМЕТИЛБЕНЗОФУРАНИЛ-7)-N-МЕТИЛКАРБАМАТА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ ФОТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

О-(2,3-дигидро-2,2-диметилбензофуранил-7)-N-метилкарбамат (в дальнейшем О-(2,3-ДГ-2,2-ДМБФ-7)-N- МК) (синонимы: карбофуран. фурадан, хинуфур, бетафур) – биологически активное вещество, обладающее антихолинэстеразным действием и широко применяющееся в качестве инсектицида и нематоцида [2, 6].
О-(2,3-ДГ-2,2-ДМБФ-7)-N-МК - это белый кристаллический порошок или бесцветные кристаллы, не обладающие запахом, с температурой плавления 153-1540С. При 250С его растворимость в воде составляет 0,7 г в 100 г, в этаноле - 4 г в 100 мл, дихлорметане - 2 г в 100 мл, ацетоне - 15 г в 100 мл [5, 7].
О-(2,3-ДГ-2,2-ДМБФ-7)-N-МК высокотоксичен для теплокровных. При пероральном введении его LD50 для крыс составляет 8-14 мг/кг, для собак - 19 мг/кг [2, 3].
Отмечены многочисленные случаи летального отравления людей данным веществом как на территории Российской Федерации, так и за еѐ пределами [1, 4].
Широкое использование О-(2,3-ДГ-2,2-ДМБФ-7)-N-МК, его высокая токсичность, наличие летальных отравлений обусловливают необходимость изучения этого соединения в химико-токсикологическом отношении.
Вместе с тем, до настоящего времени отдельные вопросы химико-токсикологического анализа О-(2,3-ДГ- 2,2-ДМБФ-7)-N-МК остаются недостаточно изученными. В частности, это касается вопросов идентификации и количественного определения этого вещества в биологических объектах.
Одним из методов идентификации и количественного определения, достаточно простых и доступных большинству судебно-химических и клинических лабораторий, является фотометрия.
Целью настоящей работы явилось изучение особенностей количественного определения О-(2,3-ДГ-2,2- ДМБФ-7)-N-МК в биологическом материале с применением фотометрического метода.
Материалы и методы исследования.
Объектом исследования явился О-(2,3-дигидро-2,2-диметилбензофуранил-7) метилкарбамат (О-(2,3-ДГ- 2,2-ДМБФ-7)-N-МК) фирмы «FMS Corporation» (США) с содержанием основного вещества не менее 99% (определено методом ГЖХ).
В качестве аналитического метода выбрана фотометрия в видимой области спектра. В качестве хромогенной реакции – реакция азосочетания после предварительного расщепления фуранового цикла О-(2,3-ДГ- 2,2-ДМБФ-7)-N-МК в щелочной водно-этанольной среде [2].
Для повышения точности и правильности определения О-(2,3-ДГ-2,2-ДМБФ-7)-N-МК при оценке его количественного содержания в субстанции и биологическом материале нами предложен модифицированный вариант данной хромогенной реакции и разработана соответствующая методика.
Разработанная методика была применена в дальнейшем для определения О-(2,3-ДГ-2,2-ДМБФ-7)-N-МК в биологическом материале (ткани печени и крови).
Предварительно готовили модельные смеси рассматриваемого соединения (размер частиц 5-50 мкм) с биоматериалом (тканью печени (размер частиц 0,2-0,5 см) или кровью), которые сохранялись 24 часа при 16- 18оС.
Для изолирования О-(2,3-ДГ-2,2-ДМБФ-7)-N-МК из биологических объектов (модельных смесей вещества с тканью печени или кровью) применялась смесь растворителей этилацетат-ацетон (1:1 по объѐму). Изолировали путѐм двукратного настаивания модельных смесей со смесью этилацетат-ацетон (1:1) в условиях, когда масса изолирующего агента в 2 раза превышала массу модельной смеси, а продолжительность каждого настаивания составляла полчаса. Отдельные извлечения объединяли.
Определѐнное количество объединѐнного извлечения из каждой модельной смеси наносили на пластину «Сорбфил» UV-254 и хроматографировали, используя систему растворителей гексан-ацетон (6:4). На хроматограммах в УФ- свете наблюдали тѐмное пятно О-(2,3-ДГ-2,2-ДМБФ-7)-N-МК (Rf=0,64±0,03).
Хроматограммы высушивали и проводили определение О-(2,3-ДГ-2,2-ДМБФ-7)-N-МК фотометрическим методом в соответствии с разработанной методикой.
Результаты исследования и их обсуждение.
Известный вариант определения О-(2,3-ДГ-2,2-ДМБФ-7)-N-МК на основе расщепления его фуранового цикла и взаимодействия образующегося продукта с солью диазония осуществлялся после хроматографирования аналита в тонком слое силикагеля путѐм обработки поверхности хроматограммы водно-этанольным раствором гидроксида щелочного металла с последующей обработкой кислым раствором диазотированного 4-нитроанилина и количественной оценкой содержания О-(2,3-ДГ-2,2-ДМБФ-7)-N-МК по интенсивности и площади образующегося окрашенного пятна.
Данный вариант характеризуется недостаточно высокой точностью определения (полуширина доверительного интервала (n=6; Р=0,95) составляет 7-9 %), в связи с чем нами предложена модификация известного способа, состоящая в том, что в качестве диазосоставляющего используется диазотированный 2-(n- аминобензолсульфамидо)-тиазол, после получения окрашенного продукта (азокрасителя) на хроматограмме его элюируют из сорбента ледяной уксусной кислотой, а образующийся окрашенный элюат фотометрируют в видимой области спектра.
Методика фотометрического определения О-(2,3-ДГ-2,2-ДМБФ-7)-N-МК согласно модифицированному варианту состояла в том, что 0,8 мл раствора анализируемого вещества в легколетучем растворителе (ацетоне) наносили в виде полосы шириной на хроматографическую пластину типа «Силуфол UV-254». После испарения растворителя осуществляли хроматографирование с использованием подвижной фазы гексан-ацетон (6:4). Хроматограмму проявляли в УФ–свете. Анализируемое вещество обнаруживалось в виде тѐмных пятен на более светлом общем фоне пластин с Rf=0,640,03. Пятна на хроматограмме обрабатывали 15 % раствором гидроксида калия в среде этанол-вода (6:4) и выдерживали в течении 5 минут под стеклом. По истечении указанного времени хроматограмму обрабатывали 0,1 % раствором диазотированного 2-(n-аминобензолсульфамидо)-тиазола, выдерживали в течение 5 минут и высушивали в токе воздуха при комнатной температуре. Участки хроматограммы с окрашенными в красный цвет пятнами образовавшегося на поверхности сорбента азокрасителя вырезали из пластины и элюировали азокраситель из каждого пятна 5 мл ледяной уксусной кислоты. Оптическую плотность окрашенного элюата измеряли на фотоэлектроколориметре КФК-2 при длине волны 400 нм в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм. Исходя из величины оптической плотности окрашенного раствора, определяли количественное содержание О-(2,3-ДГ-2,2-ДМБФ-7)-N-МК, используя уравнение градуировочного графика, которое в данном случае имело вид: А = 0,02650•С-0,00122, где А – оптическая плотность фотометрируемого расвора; С – концентрация анализируемого вещества в фотометрируемом растворе, мкг/мл.
Предлагаемый модифицированный вариант определения характеризуется достаточно высокими воспроизводимостью и правильностью. Доверительный интервал (n=6; Р=0,95) составляет 1,36 %, что в 5-6 раз меньше соответствующей ошибки при использовании известного варианта проведения фотометрического определения.
Результаты определения О-(2,3-ДГ-2,2-ДМБФ-7)-N-МК в биологическом материале (ткани печени и крови) с использованием разработанной методики представлены в Табл.1.
                                                                                                                             Таблица 1

 Результаты количественного определения О-(2,3-ДГ-2,2-ДМБФ-7)-N-МК в модельных смесях с биологическими объектами

Как свидетельствуют полученные данные, при содержании анализируемого вещества в количестве 1,25- 50,0 мг в 25 г биологического объекта разработанная методика позволяет определять в ткани печени 90,67-91,38
%, а в крови 91,46-92,01 % данного соединения с полушириной доверительного интервала соответственно 2,08- 4,28 % и 1,96-3,96 %.
Открываемый минимум данной методики (в 100 г биологического объекта) составляет: 0,4 мг вещества в печени и 0,3 мг - в крови.
Выводы.
1. Предложены условия получения окрашенного продукта О-(2,3-дигидро-2,2-диметилбензофуранил-7)-N- метилкарбамата на основе модифицированного варианта реакции расщепления фуранового цикла анализируемого вещества и проведения сочетания с солью диазония.
2. Разработана методика определения рассматриваемого соединения в биологических объектах (ткани печени и крови) с использованием предложенного варианта реакции азосочетания. Полуширина доверительного интервала при содержании 1,25-50,0 мг О-(2,3-дигидро-2,2-диметилбензофуранил-7)-N-метилкарбамата в 25 г печени и крови составляет соответственно 2,08-4,28 % и 1,96-3,96 %.

Список литературы

1. Изолирование карбофурана из биологического материала, его идентификация и количественное определение / Р.Г. Мансурова, Н.В. Кубасова, В.В. Попкова, Ф.Г. Юсупова // Актуальные вопросы судебной медицины и права.- Казань, 2010.- Вып. 1.- С. 123-127.
2. Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. Т. 1 / под ред. М.А. Клисенко.- М.: Колос, 1992.- 566 с.
3. Определение карбофурана в биологическом материале растительного происхождения / В.К. Шорманов, С.Г. Галушкин, А.П. Терских [и др.] // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье».- 2013.-№ 3.-С. 107-113.
4. Определение карбофурана при судебно-химическом исследовании биологического материала / В.К. Шорманов, Е.А. Коваленко, Е.П. Дурицын [и др.] // Судебно-медицинская экспертиза.-2013.-Т. 56, № 4.-С. 30-34.
5. Справочник по пестицидам / Н.Н. Мельников, К.В. Новожилов, С.Р. Белан, Т.Н. Пылова. -М.: Химия, 1985.-52 с.
6. Справочник по пестицидам / под ред. проф. А.В. Павлова.- Киев: Здоровья, 1986.- 131 с.
7. Судебно-химическое определение фурадана / В.К. Шорманов, В.П. Иванов, В.А. Королев [и др.] // Судебно-медицинская экспертиза. -2005. –Т. 48, № 3. – С. 27-31.