ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ УГЛЕВОДОВ В ЛЕКАРСТВЕННОМ РАСТИТЕЛЬНОМ СБОРЕ «ЛОРПОЛИФИТ»

Аннотация: методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза проведено качественное и количественное определение углеводов в лекарственном растительном сборе
«Лорполифит». Представлены данные о составе, содержании свободных и связанных сахаров в исследуемом сборе.
Ключевые слова: лекарственный растительный сбор, углеводы, качественный и количественный анализ, высокоэффективная жидкостная хроматография.
Введение
Лекарственные растительные сборы представляют собой смеси нескольких видов измельченного лекарственного растительного сырья (ЛРС) содержащие сумму биологически активных веществ (БАВ) различных групп – флавоноиды, полисахариды, сапонины, эфирные масла и др., оказывающих на организм положительное комплексное влияние.
Углеводы играют важную роль в жизни растений, являясь с одной стороны опорными скелетными веществами (клетчатка, гемицеллюлоза, пектин), с другой, будучи запасными веществами, принимают участие в обмене веществ (крахмал, инулин, сахара), служат одним из главных источников энергии [13, 15].
В настоящее время существенно возрос интерес к растительным полисахаридам. Согласно результатам экспериментально-наукометрического исследования, проведенного в рамках анализа современного состояния изученности полисахаридов, число работ, относящееся к области медицины составило 27%, иммунобиологии и микробиологии – 22% от общего числа работ посвященных химии полисахаридов [8]. Полисахариды – углеводы, расщепляющиеся при гидролизе с образованием двух и более молекул моноз (моносахаридов) [13] и обладающие выраженным противовоспалительным, противовирусным, отхаркивающим, иммунотропным, противомикробным, фармакосанирующим, общеукрепляющим и другими эффектами [4, 5, 9].
В технологическом и биофармацевтическом планах углеводы способствуют улучшению растворения и всасывания БАВ фитопрепаратов, усиливают их действие, снижают возможное негативное побочное воздействие фитопрепаратов на организм [6].
Сказанное выше актуализирует тот факт, что в последнее время большое внимание уделяется определению содержание углеводов (свободных и связанных сахаров) как в ЛРС, так и в фитопрепаратах [7, 8, 10-12, 14], как дополнительного или основного показателя их качества.
Идентификация углеводов и их количественное определение, необходимые для стандартизации ЛРС и сборов, представляют серьезную проблему, из-за наличия комплекса сопутствующих углеводам БАВ, мешающих проведению анализа. На современном этапе с целью проведения анализа применяются прямофазная высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), капиллярный электрофорез, спектрофотометрия [8, 10, 12, 14].
Ранее нами было количественно определено содержание суммы фруктозанов, суммы флавоноидов в изучаемом лекарственном растительном сборе спектрофотометрическими методами [1, 2].
Цель данной работы заключалась в идентификации и количественном определении углеводов (свободных и связанных сахаров) с использованием ВЭЖХ и капиллярного электрофореза для стандартизации сбора «Лорполифит», используемого в комплексной терапии заболеваний верхних дыхательных путей.
Экспериментальная часть
Объектом исследования являлся сбор «Лорполифит» состоящий из листьев подорожника (PlantagomajorL.), цветков ромашки (ChamomillarecutitaL.), цветков ноготков (CalendulaofficinalisL.), травы хвоща (EquisetumarvenseL.), травы тысячелистника (AchilleamillefoliumL.), травы зверобоя (HypericumperforatumL.), корней и корневищ девясила (InulaheleniumL.) – лекарственного растительного сырья, отвечающего требованиям ГФ XI издания [3].
На первом этапе идентифицировали углеводы с помощью качественных реакций. Около 5 г изучаемого сбора, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм, помещали в коническую колбу, прибавляли 30 мл воды и нагревали на кипящей водяной бане в течение 15 мин. После охлаждения в течение 30 мин извлечение фильтровали через ватный тампон в мерную колбу вместимостью 50 мл. Экстракцию повторяли с 20 мл воды в течение 15 мин. После охлаждения извлечение фильтровали в ту же мерную колбу. Объем раствора в колбе доводили водой до метки и перемешивали (раствор А).
Для очистки от полифенольных соединений 15 мл раствора А пропускали через колонку диаметром 1 см заполненную 3 г алюминия оксида для хроматографии II степени активности – получали очищенное водное извлечение (раствор Б).
Свободные сахара определяли реакцией Бертрана с реактивом Фелинга. К 1 мл раствора Б (извлечение из сбора) прибавляли 1 мл жидкости Фелинга (смесь реактива I и реактива II) и нагревали на кипящей водяной бане. Для идентификации связанных сахаров к 2 мл раствора Б прибавляли 2 мл кислоты серной разведенной и нагревали на кипящей водяной бане в течение 5 мин (раствор В). После охлаждения к 1 мл гидролизата
прибавляли 1 мл реактива Фелинга и нагревали на кипящей водяной бане.
На втором этапе изучали качественный и количественный состав углеводов в сборе «Лорполифит» методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Agilent 1100. Свободные сахара определяли по следующей методике: к 30 мг образца сбора измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм, прибавляли 1 мл воды в пробирку с завинчивающейся пробкой, нагревали при 900С до набухания сырья и экстрагировали углеводы в течение 1 ч при температуре 250 С при встряхивании.
Полученное извлечение центрифугировали 10 минут при 14000 об/мин, добавляли активированный уголь (30 мг), встряхивали и снова центрифугировали 10 минут при 14000 об/мин. Аликвоту 20 мклсупернатанта анализировали методом прямофазной ВЭЖХ на колонке Luna NH2 4,6 х 250 мм (5 мкм) или аналогичной с подвижной фазой ацетонитрил – вода (70:30) при скорости потока 1 мл/мин, при комнатной температуре с рефрактометрической детекцией.
Для анализа связанных сахаров к 30 мг образца сбора, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм, прибавляли 1 мл 1 М раствора кислоты хлористоводородной и проводили гидролиз при 1000С в течение 2,5 ч. Полученное извлечение центрифугировали 10 минут при 14000 об/мин. К 0,5 мл супернатанта прибавляли 1,5 мл воды. 2 мл полученного раствора пропускали через обращеннофазный концентрирующий патрон (Диасорб C16), отбрасывая первые 1,8 мл и собирая последующие 0,2 мл.
К 20 мкл раствора смеси стандартов в концентрации 1 г/л каждого углевода (внешний стандарт) и исследуемого раствора прибавляли 20 мкл раствора внутреннего стандарта (раствор глюкозамина с концентрацией 1 г/л) и упаривали на вакуумном центрифужном испарителе типа SpeedVac с подогревом в полипропиленовой пробирке. К высушенной пробе добавляли 20 мкл 0,5 М раствора РМР (1-фенил-3-метил-5- пиразолон) в метаноле и 20 мкл 0,3 М раствора калия гидроксида, тщательно встряхивали на вихревом шейкере и термостатировали при температуре 700С в течение 2 ч. Пробу нейтрализовывали 20 мкл 0,3 М раствора кислоты хлористоводородной и дважды экстрагировали избыток экстрагента РМР 500 мкл бензола. Остаток упаривали на SpeedVac с подогревом и растворяли в 500 мкл смеси ацетонитрил – вода (1:9). Полученную смесь анализировали методом капиллярного электрофореза на приборе AppliedBiosystems 270Т с УФ-детектированием при длине волны 245 нм и температуре 300С.
Результаты и их обсуждение.
При проведении химических реакции на свободные сахара наблюдался положительный результат – выпадал красно-оранжевый осадок оксида меди (I), что свидетельствовало о наличии данных веществ. При проведении последующих реакций (после гидролиза) выпадал красно-оранжевый осадок оксида меди (I), объем которого значительно превышал объем осадка до проведения гидролиза, свидетельствовавший о присутствии в исследуемых образцах сбора связанных сахаров.
При проведении ВЭЖХ отношение пиков и расчет концентраций проводили по внешнему стандарту, содержащему смесь анализируемых углеводов в концентрации 1 мг/мл. Хроматограммы стандартов и исследуемого образца представлены на Рисунках 1, 2


Рис.1. Хроматограмма смеси стандартов 1 мг/мл

Названия пиков в порядке их обозначения на рисунке:
- Glycerol (глицерол)
- fructose (фруктоза)
- glucose (глюкоза)
- sucrose (сахароза)


Рис.2. Хроматограмма водного извлечения из сбора «Лорполифит»

 Названия пиков в порядке их обозначения на рисунке:
- fructose (фруктоза)
- glucose (глюкоза)
- sucrose (сахароза)

Анализ хроматограмм показывает, что в исследуемом сборе в качестве свободных сахаров присутствуют фруктоза, глюкоза, сахароза, содержание которых составляет 2,85%; 2,73%; 0,3% соответственно (Табл.1).

                                                                                                                              Таблица 1

Содержание свободных углеводов в сборе «Лорполифит»

Сумма содержания свободных сахаров в сборе «Лорполифит» составляет 5,88%.
При анализе связанных сахаров методом капиллярного электрофореза отношение пиков и расчеты концентрации углеводов проводили по внутреннему (глюкозамину) и внешнему стандарту – смеси пяти анализируемых углеводов в концентрации 1 г/л.



Рис.3. Электрофореграмма смеси стандартов сахаров с концентрацией 1г/л Названия пиков в порядке их обозначения на рисунке:
- d-mannose-PMP (d-манноза-PMP)
- glucosamine-PMP (глюкозамин-PMP)
- glucose-PMP (глюкоза-PMP)
- d-xylose-PMP (d-ксилоза-PMP)
- d-galactose-PMP (d-галактоза-PMP)
- d-arabinose-PMP (d-арабиноза-PMP)


Рис.4. Электрофореграмма продуктов гидролиза исследуемого образца сбора Названия пиков в порядке их обозначения на рисунке:
- d-mannose-PMP (d-манноза-PMP)
- glucosamine-PMP (глюкозамин-PMP)
- glucose-PMP (глюкоза-PMP)
- d-xylose-PMP (d-ксилоза-PMP)
- d-galactose-PMP (d-галактоза-PMP)
- d-arabinose-PMP (d-арабиноза-PMP)

Анализ электрофореграмм показывает, что связанные сахара в сборе представлены: маннозой, глюкозой, ксилозой, галактозой, арабинозой (Рисунок 3, 4) с содержанием 0,4%; 0,47%; 0,9%; 1,6%; 0,7% соответственно (Табл.2).

                                                                                                                              Таблица 2
Содержание связанных углеводов в сборе «Лорполифит»

Сумма связанных сахаров в сборе «Лорполифит» составляет 6,8%. 

Выводы
1. С помощью качественных реакций, метода ВЭЖХ и капиллярного электрофореза доказано наличие свободных и связанных сахаров в сборе «Лорполифит».
2. Свободные сахара в изучаемом сборе представлены фруктозой 2,85%, глюкозой 2,73%, сахарозой 0,3%, сумма содержания которых равна 5,88%.
3. Связанные сахара в изучаемом сборе представлены маннозой 0,4%, глюкозой 3,2%, ксилозой 0,9%, галактозой 1,6%, арабинозой 0,7%. Сумма содержания связанных сахаров составляет 6,8%.

Список литературы

1. Буханова У.Н. Методика определения суммы фруктозанов и фруктозы в сборе «Лорполифит» / У.Н. Буханова, Д.М. Попов, Н.Г. Селезенев // Фармация. – 2013. – №1. – С. 22-24.
2. Буханова У.Н. Разработка методик качественного и количественного определения суммы флавоноидов в сборе «Лорполифит» / У.Н. Буханова, Д.М.Попов, Н.Г. Селезенев // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. – 2012. – №3. – С.11-15.
3. Государственная фармакопея СССР: Вып.2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье/ МЗ СССР.-XI изд. доп. – т М.: Медицина,1989. – 400 с.
4. Иммуномодулирующая и противоопухолевая активность полисахаридов растительного происхождения / А.В. Сергеев [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1985. – Т.100, № 12. – С. 741-743.
5. Коренская И.М. Лекарственные растения и лекарственное растительное сырье, содержащее витамины, полисахариды, жирные масла / И.М. Коренская, Н.П. Ивановская, О.А. Колосова // ИПЦ Воронежского госуниверситета. – 2008. – 88с.
6. Минина С.А. Химия и технология фитопрепаратов: учеб. пособие для вузов / С.А. Минина, И.Е. Каухова. – М.: изд. дом «ГЭОТАР-МЕД», 2004. – 558 с.
7. Наумова О.А. Качественное и количественное определение углеводов в плодах бархата амурского / О.А. Наумова, Д.М. Попов // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. – 2011. – № 8. –С. 29-32.
8. Оленников Д.Н., Кащенко Н.И. Полисахариды. Современное состояние изученности: экспериментально- наукометрическое исследование // Химия растительного сырья. 2014. №1. С. 5-26.
9. Перспективы использования растительных полисахаридов в качестве лечебных и лечебно- профилактических средств / Криштанова Н.А., Сафонова М.Ю., Болотова В.Ц., Павлова Е.Д., Саканян Е.И. // Вестник ВГУ. Сер. Химия. Биология. Фармация. – 2005. – №1. – С. 212-221.
10. Попов Д.М. Метод ВЭЖХ и определение углеводов в лекарственном растительном сырье / Д.М. Попов, Н.А. Боровикова, Н.Г. Селезенев // Фармация. – 2014. – №1. – С. 3-5.
11. Попов Д.М., Наумов А.В. Качественное и количественное определение углеводов в траве звездчатки средней (мокрицы) (StellariamediaL.) // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. 2010. №7. С. 157-160.
12. Попов Д.М., Зарубина Н.П. Сравнительное качественное и количественное определение углеводов в цветках и листьях липы сердцевидной // Регистрация и разработка лекарственных средств. 2013. № 2(3). С. 50-53.
13. Самылина И.А. Фармакогнозия: учебник / И.А. Самылина, Г.П. Яковлев. – М.: изд. группа «ГЭОТАР- Медиа», 2013. – 976 с.
14. Селезенев Г.Н. Идентификация углеводов в урологическом сборе с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) / Г.Н. Селезенев, Д.М. Попов, Н.Г. Селезенев // Материалы Межрегиональной научной конференции Рязанского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова с междунар. участием / под общ. ред. заслуж. раб. высш. шк. РФ, проф. В.А.Кирюшина. – Рязань: РИО РязГМУ, 2014. – С.337-339.
15. Энциклопедический словарь лекарственных растений и продуктов животного происхождения: учеб. пособие / Г.П. Яковлев; под ред. Яковлева Г.П., Блиновой К.Ф. – СПб.: СпецЛит, 1999. – 406 с.