ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ СУБПОПУЛЯЦИЙ КЛЕТОК КРОВИ У ДЕТЕЙ С АЛЛЕРГИЕЙ

Хорошо известно, что развитие ребенка от рождения до 18 лет сопровождается значительными изменениями структуры лейкоцитов и лимфоцитов периферической крови и зачастую эти изменения сопровождают и более поздние периоды жизни человека. [4, 12]. Иммунофенотипирование является важным инструментом для обоснования различных диагнозов: иммунодефициты, лейкозы, аллергии и другие заболевания сопровождаются значительными и характерными для этих заболеваний структурными изменениями субпопуляций лейкоцитов. [2]. Наиболее драматичные изменения в структуре этих клеток крови происходят в раннем возрасте (до 1 года) и в первые годы жизни ребенка.[6, 9, 11, 12].
Основой для решения проблемы клинической интерпретации любого лабораторного показателя является обнаружение отклонений от нормы его значений, характерных для того или иного заболевания. Таким образом, ключом к решению этой проблемы при проведении лабораторных тестов в педиатрии является знание возрастной нормы значений исследуемого лабораторного показателя [5, 10, 12]. Следует отметить, однако, что приводимые в литературе референтные значения обладают значительной вариабельностью, связанной как непосредственно с различиями в методах выполнения исследований, так и с региональными особенностями популяции, из которой формировалась референтная группа [10, 12]. Формирование референтной группы в педиатрии связано со значительными этическими проблемами, что существенно ограничивает проведение таких исследований. Отсутствие возможности сформировать полноценную референтную группу детей приводит к частому использованию в педиатрии взрослых норм [12].
Публикуемые исследования, предлагающие возрастные нормы лабораторных тестов, страдают рядом недостатков, что не позволяет обобщить их (ограниченное число детей, включенных в исследование, разные и несопоставимые возрастные диапазоны, разное оборудование и реагенты, разный набор исследуемых параметров и др.).
Другой важной проблемой при использовании лабораторных показателей, существенно зависящих от возраста, является оценка истинной информативности этих показателей (не связанной с возрастом) для дифференциальной диагностики заболеваний, что важно для обоснования патогенетических моделей изучаемых заболеваний.
Для решения последней проблемы используются подходы, связанные с различными преобразованиями значений измеряемых лабораторных показателей. Так логарифмирование меняет масштаб значений и позволяет использовать шкалу с неравномерными интервалами значений, отличающимися по величине на порядок. Во многих случаях распределение так преобразованного показателя приближается к нормальному распределению. Для нормально распределенных показателей в ряде работ используется центрирование и нормирование по стандартному отклонению. Однако такие преобразования фактически являются изменением масштаба измерений и не исключают имеющуюся у лабораторного показателя зависимость от возраста. В большом числе работ проблема исключения зависимости изучаемых показателей от возраста решается тем, что исследование проводится на очень узкой возрастной группе детей: от 1 до 4 лет [1], 2-6 лет [8], и т.д., что позволяет обнаружить показатели, связанные с определенной патологией в конкретной возрастной группе детей. Получаемые при этом результаты зависят от конкретной постановки задачи и не позволяют сопоставлять результаты разных исследований, проведенных разными лабораторными методами для разных возрастных групп детей.
Таким образом, поиск методов, позволяющих исключить влияние возраста при анализе и клинической интерпретации результатов лабораторных исследовании, сохраняет актуальность.
Описанная проблема чрезвычайно актуальна для такой бурно развивающейся области лабораторных исследований, как иммунофенотипирование. Активное созревание иммунной системы в процессе роста ребенка, а также тот факт, что именно иммунная система является основным барьером на пути любой инфекции определяет чрезвычайную изменчивость показателей этого исследования (субпопуляции Т и В лимфоцитов и других иммуно-компетентных клеток), в первую очередь, связанную с возрастом ребенка, что особенно актуально для педиатрии. При клинической интерпретации результатов проведенного иммунофенотипирования, отдельные показатели которого имеют выраженную и достоверную возрастную динамику, исследователи упираются в проблему выбора (определения) референтных значений для огромного количества показателей, число которых постоянно растет и уже сегодня приближается к нескольким десяткам. До настоящего времени актуальной остается проблема ответа на вопросы, что есть норма и как сопоставить различные нормативы, полученные и используемые в разных исследованиях. Сохраняет актуальность также проблема сопоставления результатов проведения иммунофенотипирования при обследовании детей в норме и при различных заболеваниях в нескольких когортных исследованиях и обобщения полученных в разных исследованиях результатов при проведении мета-анализа.
Целью настоящего исследования является оценка перспективности использования предложенного метода двойного нормирования исходных лабораторных данных при выявлении паттерна иммунофенотипирования, характерного для аллергии у детей.
Материалы и методы.
Исследование проведено на ретроспективных данных, включающих результаты иммунофенотипирования у 166 детей, проходивших обследование и лечение на базе отделений ДГКБ №13 им Н.Ф. Филатова или наблюдавшихся в специализированном городском аллерго-пульмонологическом центре больницы. Анализировались 50 показателей, которые включали подсчет общего числа лейкоцитов, определение фагоцитарных индексов, подсчет процентного содержания и абсолютного количества субпопуляций Т и В лимфоцитов. Исследовались также уровни иммуноглобулинов (IgG, IgM и IgA). Возраст детей, включенных в исследование, находился в диапазоне от 0,04 до 17,8 лет; медиана возраста с межквартильным интервалом на совокупной выборке составила 4,97 (2,26;8,44) года.
Включенные в выборку дети с аллергией, состоящиена учете в аллерго- пульмонологическом центре(зав. отделением: профессор, д.м.н. Филатова Т.А.), проходили регулярное обследование по поводу аллергий различной природы (аллергические риниты, атопические дерматиты, другие аллергические дерматиты, почесуха Бенье, аллергическая крапивница). Группу сравнения составили дети с другими заболеваниями не аллергической природы. Диагнозы были верифицированы результатами тщательного обследования ребенка с использованием данных опроса (анамнез), результатами клинических, функциональных (проведение кожных аллергопроб) и лабораторных методов исследования (аллергологические, клинические и биохимические анализы, иммунологические, бактериологические), а также историей лечения пациента.
Иммунофенотипирование проводилось в лаборатории биохимии и иммунологии на проточном цитофлуориметре компании BeckmanCoulter серии Cytomics FC 500 и включало оценку неспецифической резистентности организма: определение фагоцитарной активности нейтрофилов, НСТ-тест, оценку клеточного звена иммунитета: В-лимфоциты (CD19+); общее количество Т-лимфоцитов (СD3+); Т-лимфоциты – хелперы (СD3+СD4+); Т-лимфоциты – цитотоксические (СD3+CD8+); Т-лимфоциты ранней активации(СD3+СD25+); Т- лимфоциты ранней активации(СD3+СD4+СD25+);Т-лимфоциты поздней активации(СD3+HLA-DR+СD25+); натуральные киллеры, моноциты (CD16); Т-лимфоциты с рецепторами к интерлейкину (CD25); NK-киллеры (CD56); моноциты (CD14+ CD16+); активированные моноциты (CD16+ HLA-DR+; CD 14+ HLA-DR+) и др.
Статистический анализ данных проводился с использованием критерия Стьюдента (Т-критерия) для нормально распределенных показателей и непараметрического критерия - точного метода Фишера, не зависящего от характера распределения показателя. Для формирования графиков, а также для проверки нормальности распределения количественных признаков, получения описательной статистики и проведения сравнения сформированных групп пациентов использованы пакеты программ EXCEL 2010 и STATISTICA 6.0.
Результаты и обсуждение.
Центральной проблемой при проведении клинической интерпретации результатов измерения клеточных субпопуляций у детей с разной патологией остается более точная информция о возраст-зависимых изменениях размеров субпопуляций Т и В лимфоцитов и других клеток крови у здоровых детей.
В нашем исследовании на первом этапе мы использовали нормативы для исследуемых характеристик, используемые в лаборатории. Тем не менее, открытым оставался вопрос, сохраняется ли достоверная возрастная динамика этих показателей в группе детей, включенных в настоящее исследование, у которых иммунная система по отдельным показателям изменена из-за заболевания, или частично или полностью пришла в норму на фоне длительно продолжающейся ремиссии основного заболевания.
При выделении возрастных групп для сравнения мы использовали возрастные диапазоны: в младшую группу вошли 55 детей в возрасте до 1,99 лет (группа 1), в следующие группы вошли 44 ребенка от 2 до 5,99 лет (группа 2), 49 детей в возрасте от 6 до 12,99 лет (группа 3) и в старшую возрастную группу вошли 18 подростков в возрасте от 13 до 17,99 лет (группа 4).
В Табл.1 представлены средние значения основных показателей иммунофенотипирования в сформированных по возрасту группах детей.
                                                                                                                      Таблица 1

 Изменения средних значений результатов иммунофенотипированияу детей с увеличением возраста

*) При описании различий указаны номера групп, достоверно различающихся по средним значениям соответствующего показателя, и в скобках соответствующие р-значения (сравнение по t-критерию)

В Табл.2 представлены средние значения иммуноглобулинов(IgG, IgM, IgA)в тех же сформированных по возрасту группах детей.
                                                                                                                             Таблица 2 

Изменения средних значений иммуноглобулинов (IgG, IgM, IgA) у детей с заболеваниями дыхательной системы с увеличением возраста

Из результатов, представленных в Табл.1 и 2, следует, что в исследуемой группе детей достоверная зависимость от возраста имеет место для большинства измеренных показателей за исключением 4 показателей, возрастная динамика которых имеет место, но результаты сравнения средних в разных возрастных группах оказались недостоверными.
Для выявления возрастных особенностей исследуемых показателей рассмотрим в качестве примера распределение субпопуляции лимфоцитов CD3+CD25+ в совокупной группе исследования (Рисунок 1).
На рисунке приведена возрастная динамика абсолютных значений CD3+CD25+. Для оценки направленности изменения значений CD3+CD25+ с возрастом приведен график линейной регрессии, которая оказалась достоверной и свидетельствует о достоверном снижении абсолютных значений (p=0,0057).




Рис.1. Изменения абсолютных значений субпопуляции лимфоцитов CD3+CD25+ в зависимости от возраста детей.

Как следует из приведенных графиков, от возраста зависит не только величина показателя CD3+CD25+, но также и величина разброса, которая при малом возрасте имеет разброс в 2 раза больший по сравнению с разбросом в возрасте 13-18 лет. Аналогичная зависимость от возраста имеет место для большого числа исследованных показателей (Табл.1), причем разброс значений в возрасте до 2 лет превышает разброс показателя в возрасте 13-18 лет до 6-7 раз.
Для того, чтобы исключить зависимость от возраста исследуемых показателей, мы предлагаем проводить двойное нормирование: по величине значений и по величине разброса.
Для проведения нормирования были выделены 10 возрастных диапазонов: мелкие по 1 году от 0 до 6 лет (когда наблюдаются более значительные изменения как самих показателей, так и их разбросов) и четыре более крупные для возраста от 6 до 18 лет (6-7,99 лет; 8-9,99; 10-12,99; 13-17,99 лет), когда зависимость изменения значений от возраста менее выражена. Для каждого возрастного интервала были получены значения медиан, а также границ нижней (25%) и верхней (75%)квартилей значений.
В каждом отдельном возрастном диапазоне было проведено двойное нормирование:
• нормирование значений по медиане (деление всех значений показателя в каждой возрастной подвыборке на соответствующую медиану;
• нормирование разброса с использованием межквартильного интервала в качестве центрального и формирование трех градаций признака. 1) значения, расположенные в нижней квартили распределения подвыборки по возрасту; 2) диапазон значений, соответствующий межквартильному интервалу; 3) значения, расположенные в верхней квартили. Попадание значений показателя в одну из этих трех градаций кодировалось кодами 1, 2 и 3, соответственно.
Такое двойное преобразование показателей привело к тому, что медиана значений по совокупной выборке при любом возрасте была равна единице, а распределение каждого показателя было представлено в единой шкале с тремя значениями, независимо от возрастного диапазона.
Для того, чтобы убедиться в том, что в результате проведения двойного нормирования по медиане и разбросу значений нам удалось выделить в каждом показателе ту часть информации, которая не связана с возрастом, мы снова провели сравнение 4-х групп по возрасту (возрастные диапазоны те же, что и в Табл.1). Сравниваемые возрастные группы не различались достоверно ни по одному из исследуемых иммунных показателей, что мы расценили как получение ожидаемого результата: нам удалось из всех показателей исключить составляющую, зависящую от возраста. Теперь можно рассчитывать на то, что различия, выявляемые при сравнении групп с разной патологией или с контрольной выборкой несут в себе информацию, характеризующую непосредственно исследуемую патологию.
В качестве первой задачи, которую мы решали с использованием предложенного двойного нормирования исследуемых иммунологических показателей, мы попытались выявить структуру субпопуляций клеток крови, характерную для аллергии у детей.
Сравнение группы детей с аллергией (Группа 1) и группы детей с другими заболеваниями с отсутствующей аллергической компонентой (группа 2) мы провели в два этапа. На первом этапе эти группы сравнивались на списке исходных (не нормированных) признаков. При этом достоверные различия были выявлены практически по всем перечисленным в обеих таблицах показателям (абсолютные и относительные значения), что, несомненно, отражает их зависимость от возраста, так как сравниваемые группы достоверно различались по возрасту.
Далее сравнение было проведено на списке преобразованных показателей. При сравнении двух групп по средним значениям нормированных по медиане показателей иммунофенотипирования не выявило достоверных различий. При сравнении этих групп по тем же показателям, нормированным также и по распределению этих показателей в каждой возрастной группе (двойное нормирование) были выявлены достоверные различия в распределениях некоторых показателей (Табл.3).
                                                                                                                             Таблица 3

 Распределение показателей иммунофенотипирования в группе детей с аллергией (группа 1) и в группе сравнения (группа 2).

*) Информация о признаках в каждой группе представлена в виде средних нормированных по возрастным медианам значений и распределения этих же показателей по трем градациям (двойное нормирование); **) достоверность различий в структуре показателей получены с использованием точного критерия Фишера.

Представленные в Табл.3 результаты в целом свидетельствуют о достоверно более частом снижении количества моноцитов у детей с аллергией (у 60%). У достоверно большего количества детей этой группы (у 71,4%) выявлены более высокие относительные и абсолютные значения NK-клеток CD3-CD16+CD56+(т.н. естественных киллеров)и абсолютные значения CD3+CD25+ (у 47,8%), попадающие в верхнюю квартиль распределения. Достоверно реже у детей с аллергией встречаются высокие значения показателя CD3+HLA- DR+,попадающие в верхнюю (4-ю)квартиль распределения значений. Достоверно реже у детей с аллергией встречаются низкие значения показателя CD3+HLA-DR+,попадающие в нижнюю (1-ю) квартиль распределения значений.
Полученные нами результаты в целом не противоречат результатам других исследований, проводимых с целью выявления характерной для аллергии у детей иммунограммы.
В частности, в работе [3] показано, что у детей с атопическим дерматитом выявлено более высокое содержание в крови NK-клеток CD3-CD16+CD56+ и более низкие значения T active CD3+HLA-DR+ по сравнению с группой здоровых детей и с группой детей, находящихся в состоянии ремиссии. Аналогичный результат получен в нашем исследовании: показано, что достоверно чаще в группе детей с аллергиями обнаруживаются уровни NK-клеток CD3-CD16+CD56+, попадающие в верхнюю квартиль распределения (p=0,02) и достоверно реже у детей с аллергией обнаруживаются значения CD3+HLA-DR+, попадающие в верхнюю (4-ю) квартиль. Выявленное в нашем исследовании (Табл.3) практически полное и достоверное отсутствие у детей с аллергиями низких относительных и абсолютных значений T- регуляторных клеток СD3+CD4+CD25+ по сравнению с детьми без атопических проявлений (4,3% против 33,3%, p=0,03), не противоречит результатам ряда других исследований, в частности на животных моделях [7], свидетельствующих об увеличении количества регуляторных Т-клеток CD4+CD25+ при аллергии. В исследовании [3]показано, что у детей при активной фазе атопического дерматита медиана относительных значений CD3+CD4+CD25+ достоверно выше, чем в группе здоровых детей и в фазе ремиссии: 17,80 (12,70; 26,30) против 8,10 (6,92; 11,1) и 2,40 (0,17;4,00), соответственно.
Таким образом, полученные нами результаты подтверждают перспективность применения предложенного преобразования для выявления показателей фенотипирования информативных для описания характерных изменений иммунной системы, связанных с конкретной патологией независимо от возраста. Мы полагаем, что использование предложенного двойного нормирования, выделяющего ту часть каждого показателя, которая несет в себе информацию непосредственно об изучаемой патологии и не зависит от возраста ребенка, позволит более точно выявлять информативные лабораторные показатели, необходимые для обоснования патогенетических моделей заболеваний, а также для более точной и обоснованной дифференциальной диагностики и прогнозирования развития и исхода этих заболеваний в процессе лечения. В перспективе, возможность исключения зависимости от возраста должна позволить более эффективно сравнивать исследования, проводимые на разных по возрасту группах детей.

Список литературы

1. Котлуков В.К., Кузьменко Л.Г. с соавт. Особенности иммунного статуса у часто и длительно болеющих детей раннего возраста с бронхиальной астмой// Педиатрия, 2007; Том 86,№4: 25-28
2. Пичугина Л.В. Изменение фенотипа лимфоцитов при неиммунодефицитных патологиях// Лабораторная Медицина, 2008; №9: 39-44
3. Сормолотова И.Н. Показатели иммунитета и качества жизни при атопическом дерматите у школьников Забайкалья// Диссертация Чита, 2014, 131 стр.
4. Huenecke S, Behl M et al Age-matched lymphocyte subpopulation reference values in childhood and adolescence: application of exponential regression analysis.// Eur J Haematol., 2008; Jun; 80(6):532-9.
5. İkincioğulları A, Kendirli T et al, Peripheral blood lymphocyte subsets in healthy Turkish children// The Turkish Journal of Pediatrics 2004; vol.46: 125-130
6. LuningPrak ET, Ross J et al. Age-Related Trends in Pediatric B-Cell Subsets.//Pediatric and Developmental Pathology: 2011; Vol. 14, No. 1: 45-52
7. Ling EM, Smith T, Nguyen XD et al. Relation of CD4+CD25+ regulatory T-cell suppression of allergen-driven T- cell activation to atopic status and expression of allergic disease//Lancet, 2004; V 363, Issue 9409, 21: 608–615.
8. Machura E, Bogdan Mazur B et al. Cytokine Production by Peripheral Blood CD4+ and CD8+ T Cells in Atopic Childhood Asthma.//Clinical and Developmental Immunology 2010; Article ID 606139, 11 pages doi:10.1155/2010/606139
9. Moraes-Pinto MI, Ono E et al. Lymphocyte subsets in human immunodeficiency virus-unexposed Brazilian individuals from birth to adulthood.// Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 2014, Nov 21 Epub, (http://dx.doi.org/10.1590/0074-0276140182)
10. Pia˛tosa B, Wolska-Kus´nierz B, Pac M et al B Cell Subsets in Healthy Children: Reference Values for Evaluation of B Cell Maturation Process in Peripheral Blood//Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 2010; 78B: 372–381.
11. Sagnia B, Ndongo F A et al. Reference Values of Lymphocyte Subsets in Healthy, HIV-Negative Children in Cameroon//Clinical and Vaccine Immunology, May 2011; 790–795.
12. Shahabuddin S., Al-Ayed I., Gad El-Rab M.O., Qureshi M.I. Age-Related Lymphocyte Subset Changes in the Peripheral Blood of Healthy Children – a Meta-Study// Transfus Med Hemother 2007;34:176–181.