Известно, что лимфоциты несут на своей мембране маркеры, способные выполнять функцию рецепторов, получившие наименование CD. На различных стадиях дифференцировки лимфоцитов экспрессируется определенный набор кластеров, что определяет функциональную активность клеток [2, 8, 17]. Способность веществ усиливать или ослаблять экспрессию кластеров дифференцировки иммуноцитов и, тем самым, модулировать их функцию, отражает иммунотропную активность препаратов [1, 18, 25]. При ожоговой болезни, как и при ряде других иммунодефицитных состояний, наблюдается не только угнетение лимфопоэза, но  и изменение мембраны лимфоидных клеток, в том числе и CD молекул, что обусловлено репрессией кластеров дифференцировки [1, 12]. Очевидно, что при этом лимфоциты имеют высокий потенциал к экспрессии маркеров CD, которая может проявиться под действием иммуностимуляторов.

Цель исследования: изучить влияние синтетического пептида Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu на экспрессию кластеров дифференцировки лимфоцитов.

Материал и методы исследования.

Пептиды из сумки Фабрициуса цыплят после выделения фракционировали с помощью гель-фильтрации и обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографией. На каждом этапе полученные фракции тестировали на наличие иммуностимулирующей активности. Дальнейшая работа велась только с активными фракциями. В результате последовательного разделения этих фракций нами был выделен пептид, обладающий по результатам скрининговых исследований иммуноактивностью, и установлена на газофазном секвенаторе (Model 477A, Applied Biosystems) его первичная структура - Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu. Исследование активности пептида проводили с использованием его синтетического аналога. Пептид синтезировали на твердой фазе с использованием Boc схемы, структуру синтезированного пептида подтверждали масс спектрометрическим анализом [12].

Мы изучали влияние пептида на кластеры дифференцировки лимфоцитов в 2-х часовой культуре клеток, полученных от 16-и больных с ожоговой болезнью (ожоги IIIб-IV степени 15-30% поверхности тела). Лимфоциты выделяли на градиенте плотности фиколл-верографин (r=1,077 г/см3).  Полученную клеточную взвесь трижды отмывали и использовали в концентрации 2,5 млн. клеток/мл. Клетки культивировали в среде RPMI-1640 в плоскодонных планшетах в объеме 0,2 мл при 37°C, в атмосфере 5% СО2 и влажности 80-90%. В культуральную среду добавляли 10% фетальной сыворотки теленка, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 2 мМ глутамина, 10 мМ Hepes- буфера. В культуру лимфоцитов вносили изучаемые пептиды в концентрации 5 пмоль/мл (опыт). В качестве контроля использовали физиологический раствор в соответствующем объеме. Экспрессию дифференцировочных антигенов определяли методом непрямой мембранной иммунофлюоресценции [1, 12]. Полученные данные обработаны с помощью пакета статистических программ Statistica 6. Статистическую значимость различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение.

Известно, что в соединения выделенные из сумки фабрициуса регулируют развитие В-лимфоцитов клеток [13, 15, 24]. Однако в нашем исследовании пептид Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu стимулирует экспрессию маркеров Т-лимфоцитов, увеличивая число клеток, несущих маркер CD2 на 26,1%, CD3 на 30,9%, CD4 на 120,2% (Таблица).

Этот факт предполагает то, что в бурсе Фабрициуса происходит дифференцировка некоторых субпопуляций Т-лимфоцитов. Это подтверждают и факты обнаружения до 4-6% Т-лимфоцитов в бурсе Фабрициуса птиц [12, 17, 18].

Таблица 1 Влияние пептида Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu на экспрессию кластеров дифференцировки лимфоцитов больных ожоговой болезнью, М±м % (n=16).

CD 2

CD 3

CD 4

CD 8

CD 16

CD 25

CD 19

CD 21

CD 22

CD 23

CD 38

CD 72

контро

59,7±

45,7±

12,4±

18,6±

10,2±

3,2±0,

5,8±0,

4,6±0,

5,2±0,

3,1±0,

8,8±0,

5,1±0,

ль

1,2

1,3

0,8

0,6

1,0

3

5

4

6

3

6

4

опыт

75,2±

59,9±

27,4±

20,1±

11,0±

3,4±0,

7,2±0,

5,3±0,

5,6±0,

2,8±0,

9,6±0,

6,0±0,

1,5*

1,4*

1,0*

0,9

1,0

3

6

6

6

2

3

4

*– достоверность различий показателей опытной и контрольной групп p< 0,001

 

Также нами было показано, что данное соединение обладает противоотечным действием [18], стимулирует регенерацию [24] и развитие макрофагов [14]. Поэтому мы предполагаем, что пептид Glu-Glu-Leu-Asn-Glu может найти свое применение в ЧС [21] при ожогах [6, 7], отморожениях [22, 23], заживлении как ран кожи [3], так и поврежденных клеток внутренних органов, в частности желудочно-кишечного тракта [4, 9] и легких [10, 11], для восстановления поврежденного головного мозга [19, 20], для нормализации работы системы иммунитета и гемостаза при химиотерапии [5, 16].

 

Список литературы

1.      Кузник Б.И., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Цитомедины. - СПб.: «Наука». - 1998. - 310 с.

2.      Кузник Б.И., Лиханов И.Д., Цепелев В.Л., Сизоненко В.А. Теоретические и клинические аспекты биорегулирующей терапии в хирургии и травматологии. - Новосибирск: Наука, 2008. – 311 с.

3.      Крюкова В.В., Подойницына М.Г., Цепелев В.Л., Курупанов С.И., Степанов А.В. Магнитоплазменная терапия как компонент интенсивной терапии у пациентов с обширными гнойными ранами // Актуальные вопросы интенсивной терапии. - 2015. - № 32. - С. 17-20.

4.      Лобанов С.Л., Степанов А.В., Лобанов Л.С. Современные подходы к лечению острого панкреатита. – Чита: Деловое Забайкалье, 2008. - 160 с.

5.      Мельникова С.Л., Степанов А.В. Лейкоцитарный фибринолиз у онкологических больных // Фундаментальные исследования. – 2013. - №3-1. – С. 117-120.

6.      Подойницына М.Г., Цепелев В.Л., Степанов А.В. Изменение микроциркуляции при дермальных ожогах // Фундаментальные исследования. - 2015. - № 1-9. - С. 1893-1896.

7.      Подойницына М.Г., Цепелев В.Л., Степанов А.В. Клиническая эффективность магнитоплазменной терапии ожогов кожи // Забайкальский медицинский вестник. - 2015. - № 2. - С. 99-102.

8.      Подойницына М.Г., Цепелев В.Л., Степанов А.В. Применение физических методов лечения ожогов кожи // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 5; URL: www.science-education.ru/128-22156.

9.      Скажутина Т.В., Цепелев В.Л., Степанов А.В., Крюкова В.В., Курупанов С.И., Сепп А.В. Эндоскопическое лечение рубцовых стенозов пищевода с целью раннего восстановления энтерального питания // Актуальные вопросы интенсивной терапии. - 2015. - № 32. - С. 28-32.

10.   Степанов А.В. Острая дыхательная недостаточность. – Чита: ИИЦ ЧГМА, 2008. - 48 с.

11.   Степанов А.В. Острые нарушения функций дыхания. Чита: ИИЦ ЧГМА, 2008. - 66 с.

12.   Степанов А.В., Цепелев В.Л., Цепелев С.Л., Аюшиев О.Д. Пептидные регуляторы гуморального иммунитета. - Чита: Поиск, 2002. - 160 с.

13.   Степанов А.В., Цепелев В.Л., Мельникова С.Л. Иммуностимулятор из центрального органа гуморального иммунитета — сумки Фабрициуса // Сибирский медицинский журнал. - 2013. - № 2. - С. 32-34.

14.   Степанов А.В., Цепелев В.Л. Влияние синтетических пептидов сумки Фабрициуса на функциональную активность макрофагов // Забайкальский медицинский вестник. - 2014. - № 2. - С. 44-47.

15.   Степанов А.В., Цепелев С.Л., Цепелев В.Л., Цыбиков Н.Н., Бямбаа А.Б. Результаты исследования эффективности синтетического иммуностимулятора нового поколения // Фундаментальные исследования.- 2012. - №12 (1). -С. 142-145.

16.   Степанов А.В., Краденов А.В. Лейкоцитарный фибринолиз в тромболитической терапии // Забайкальский медицинский вестник. - 2015. - № 1. - С. 125-128.

17.   Степанов А.В. Механизмы коррегирующего действия полипептидов из лимфоидной ткани при иммунодефицитных состояниях и воспалении: Автореф. дис. докт. мед. наук. – Иркутск, 1995.– 40 с.

18.   Степанов А.В. Пептидные регуляторы из сумки Фабрициуса // Забайкальский медицинский вестник. - 2004. - № 4. - С. 97-101.

19.   Степанов. А.В., Шаповалов К.Г. Некоторые проблемы преподавания анестезиологии и реаниматологии в медицинском Вузе // Анестезиология и реаниматология. – 2009. - №6. – С.29-30.

20.   Степанов А.В. Интенсивная терапия при черепно-мозговой травме // Забайкальский медицинский вестник.- 2002. - № 2. - С. 22-27.

21.   Степанов А.В., Любин А.В., Малежик М.С. Организация медицинской помощи при катастрофах. – Чита : ИИЦ ЧГМА, 2012. - 140 с.

22.   Шаповалов К.Г., Михайличенко М.И., Степанов.  А.В. Нарушение  функции эндотелия при холодовой травме // Актуальные вопросы интенсивной терапии. – 2007. - №22. – С.53-57.

23.   Шаповалов К.Г., Бурдинский Е.Н., Степанов. А.В. Оптимизация компонентов регуляции сосудистого тонуса и состояния микроциркуляторного гемостаза на фоне продленной регионарной блокады при местной холодовой травме // Анестезиология и реаниматология. – 2008. - №3. – С.20-21.

24.   Цепелев В.Л., Степанов А.В. Влияние регуляторных пептидов на продукцию провоспалительных цитокинов // Забайкальский медицинский вестник. - 2015. - № 2. - С. 147-150.

25.   Хавинсон В.Х., Рыжак Г.А., Линькова Н.С. Применение пептидных биорегуляторов для увелечения ресурса жизнедеятельности человека. – СПб.: ИПК «КОСТА». – 2015. – 72 с.