В последнее время отмечается повышение интереса исследователей к свободно-радикальной биологии и медицине, основу которой составляют представления о механизмах действия, молекулярно-клеточных и системных эффектах активных форм кислорода (АФК) и азота (АФА) [2, 4, 5]. В настоящее время установлено, что лечебное воздействие ряда физических факторов опосредовано через генерацию, циркуляцию и деградацию активных биорадикалов, представленных в том числе АФК и АФА, одной из основных точек приложения которых служит энергетический обмен крови. Поэтому его оценка и коррекция с помощью АФК и АФА является актуальной в плане определения эффективности проводимого лечения. Целью исследования явилось изучение влияния газообразных АФК и АФА на параметры энергетического метаболизма крови in vitro.

Материалы и методы исследования. Проведено 2 серии экспериментов на образцах консервированной крови здоровых доноров с Нижегородской станции переливания крови. В I серии каждый образец (n=10) разделяли на 5 порций по 5 мл. Первая порция – контроль без воздействий. Вторую порцию барботировали кислородно-озоновой смесью (O3 – 500 мкг/л), третью – чистым О2, четвертую и пятую – газовой смесью, содержащей синглетный кислород (СК) (при мощности генератора 50 и 100% соответственно). Продолжительность барботажа – 3мин. Синтез кислородно-озоновой смеси осуществляли с помощью озонатора «Медозонс-БМ» (Россия). Воздушный поток с СК получали с применением аппарата «Airnergy» (Германия). Во II серии экспериментов каждый образец (n=10)  разделяли на  4 порции по 5 мл. К опытным образцам крови добавляли по 0,05 (0,15 мкмоль); 0,1 и 0,2 мл (0,6 мкмоль) водного раствора динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ), приготовленных по методике А.Ф. Ванина [1]. Контроль – порция крови без воздействий. Во всех образцах определяли активность лактатдегидрогеназы в прямой (ЛДГпр) и обратной (ЛДГобр) реакциях [6], альдегиддегидрогеназы (АлДГ) – по Б.М. Кершенгольц, Л.П. Ильиной [3]. Уровень глюкозы и лактата оценивали с помощью анализатора SuperGL Ambulance. Для оценки направленности сдвигов окислительно- восстановительных реакций рассчитывали коэффициент баланса энергетических реакций (КБЭР): КБЭР=(ЛДГпр/ЛДГобр)/(ЛДГобр/ЛДГпр)×100   [6].

Результаты обрабатывали с использованием программы Statistica 6.0. Результаты и их обсуждение.

Установлено, что все изучаемые АФК обусловили нарастание активности ЛДГпр и статистически значимо снизили ЛДГобр. При этом обе изучаемые концентрации СК статистически значимо повысили активность ЛДГпр. АФК оказали влияние и на активность АлДГ. В частности, при обработке крови СК наблюдали активацию данного фермента детоксикации в отличие от кислорода и озона (Рисунок 1). Следует отметить, что указанные процессы сопряжены с сонаправленным изменением концентрации лактата в эритроцитах (Рисунок 2), уменьшающейся при действии всех изучаемых АФК (p<0,02 для всех случаев).

О3 и синглетный кислород в большей степени снижали концентрацию лактата в плазме (p<0,05). Важно отметить, что под влиянием всех изучаемых АФК происходило снижение уровня глюкозы в эритроцитах (на 65- 75% относительно контроля; p<0,05). Вероятно, это обусловлено его повышенной утилизацией в энергетическом обмене, стимулированном изучаемыми окислителями. Выявлено повышение КБЭР при воздействии АФК, приводящее к стимуляции энергетического метаболизма крови.

Таким образом, установлено, что обработка крови синглетным кислородом in vitro создает позитивные условия для функционирования лактатдегидрогеназы, приводя к соответствующим сдвигам концентрации глюкозы и лактата. Отмечено, что эффект синглетного кислорода более выражен, чем кислородно-озоновой смеси.

Предположительно, что для оптимального воздействия NO на биологические жидкости более предпочтительным по сравнению с непосредственным нитроксилированием является введение агента в депонированной форме (ДНКЖ). Во второй серии экспериментов показано, что добавление к цельной крови ДНКЖ вызвало дозозависимую стимуляцию активности ЛДГпр. При добавлении к крови больших количеств ДНКЖ активность ЛДГобр ингибировалась (Рисунок 3). Установлено, что ДНКЖ оказали положительное влияние на АлДГ, наиболее выраженное при концентрации 0,05 и 0,2 мл.

 

Насыщение крови ДНКЖ демонстрировало дозозависимое нарастание КБЭР (Рисунок 4), указывая на стимуляцию ДНКЖ энергетического метаболизма. Выявленные изменения сопровождаются снижением концентрации лактата в эритроцитах при введении ДНКЖ, что вероятно обусловлено использованием данного продукта углеводного обмена в процессах образования 2,3-дифосфоглицерата, связанного с энергетическим обменом клетки.

Таким образом, депонированные формы оксида азота, способные вследствие возможности связывания с белковыми макромолекулами к длительному сохранению в крови (в том числе in vivo) и к оптимальному по скорости высвобождению NO, оказывают выраженный стимулирующий эффект на энергетический метаболизм эритроцитов. Следует отметить, что он носит дозозависимый характер, что позитивно характеризует фармакологические свойства экзогенных ДНКЖ.

 

Список литературы

1.      Ванин А.Ф., Микоян В.Д., Кубрина Л.Н., Бородулин Р.Р., Бургова Е.Н. Моно- и биядерные динитрозильные комплексы железа с тиолсодержащими лигандами в различных биосистемах // Биофизика. 2015; 60(4): 735–47.

2.      Дубинина Е.Е. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных молекул в метаболизме тканей при состояниях окислительного стресса // Вопросы медицинской химии. 2001; 47 (6): 561–581.

3.      Кершенгольц Б.М., Ильина Л.П. Биологические аспекты алкогольных патологий и наркоманий. Якутск: Издательство ЯГУ; 1998. 150с.

4.      Малахов В.А., Завгородняя А.Н., Лычко В.С., Джанелидзе Т.Т., Волох Ф.А. Проблема оксиду азоту в неврологии. Суми: Видавництво СумДПУ им. А.С. Макаренка; 2009. 242 с.

5.      Малышев И.Ю. Введение в биохимию оксида азота: Роль оксида азота в регуляции основных систем организма // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 1997; №1: 49- 55.

6.      Соловьева А.Г., Зимин Ю.В. Новый способ оценки динамики метаболизма крови у больных с термической травмой // Современные технологии в медицине. 2012; №2: 116-117.