СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА СЕРОЛОГИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Резюме: В сравнительном аспекте дается анализ серологических (реакция иммунодиффузии) и молекулярных (полимеразно-цепная реакция) методов исследования. Показано, что серологический метод исследования обладает достаточно высокой специфичностью, но отмечаются пропуски в выявлении инфицированных животных, связанные с явлением иммунологической толерантности, когда наблюдают вирусоносительство без антителообразования. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) это метод позволяющий выявлять провирусную ДНК или вирусную РНК в образце крови животного. Однако ни один из данных методов не лишен недостатков. ПЦР - анализ выявил на 5 животных носителей инфекции больше, чем серологический метод. Но 1 случай антителоносительства не подтвердился ПЦР-анализом. Доля ПЦР в рутинных исследованиях остается крайне незначительной. Постановка полимеразной цепной реакции требует дорогостоящего оборудования и реагентов, определенных профессиональных навыков персонала.

Summary: In a comparative perspective the analysis of serology (immunodiffusion  reaction) and  molecular (polymerase chain reaction) methods. It is shown that serological research method has a high specificity, but are marked in the gaps in the identification of infected animals associated with the phenomenon of immunological tolerance, when you observe the virus without antibody production. Polymerase chain reaction (PCR) is a method allowing to detect proviral DNA or viral RNA in the blood sample of the animal. However, none of these methods are not without disadvantages. PCR analysis revealed 5 animals carriers of the infection more than serological method. But 1 case of anticolonialist was not confirmed by PCR analysis. The proportion of PCR in routine research remains extremely low. Staging polymerase chain reaction requires expensive equipment and reagents, certain professional skills of the personnel.

Ключевые слова: лейкоз КРС, реакция иммунодиффузии, полимеразно-цепная реакция, серологический метод, молекулярный метод, диагностика, антитела, инфекция, провирусная ДНК, анализ, серонегативные, серопозитивные, толерантность.

Key words: bovine leukemia, immunodiffusion reaction, polymerase-chain reaction, serological method, molecular, diagnostics, antibodies, infection, proviral DNA, analysis, seronegative, seropositive, tolerance.

Введение: Лейкоз крупного рогатого скота – хроническая инфекционная болезнь опухолевой природы, наносящая животноводству значительный экономический ущерб, который складывается из нарушения планомерного ведения племенной работы, снижения количества и качества молочной и мясной продукции, вынужденного омоложения стада, недополучения приплода, вынужденного убоя телок, падежа коров, заболевания инфицированных коров, не поддающимися лечению маститами и метритами, снижения эффективности вакцинопрофилактики в стадах, неблагополучных по лейкозу.[2,3,6,10] Кроме того, в хозяйствах, при установлении лейкоза крупного рогатого скота, расходуются средства на проведение ветеринарно- санитарных, зоотехнических и хозяйственных оздоровительных мероприятий.[4, 5,6.]

Для диагностики лейкоза применяют клинический, патологоанатомический, гистологический, гематологический, серологический и молекулярно-биологический методы (11). Появление клинических и гематологических изменений у инфицированных животных может быть длительным процессом их проявление может быть через несколько месяцев или лет. (1, 3,12,15.). При лейкозе крупного рогатого скота источником возбудителя выступает инфицированное животное. Поэтому, удаление из стада всего скомпрометированного по лейкозу скота является важным этапом проведения оздоровительных мероприятий, эффективность которых в значительной степени зависит от используемых диагностических тестов. [10, 14].

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в настоящее время считается наиболее достоверным диагностическим методом. Это высокочувствительный и специфичный метод, основанный на прямой индикации инфекционного агента и не требующий иммунологического ответа на проникновение возбудителя в организм хозяина, что дает возможность следить за ранними стадиями развития инфекции. (7, 8, 9, 13).

Цель исследования: Провести сравнительный анализ серологических (РИД) и молекулярных (ПЦР) исследований и дать оценку эффективности методов исследования.

Материалы и методы: Серологический метод диагностики проводили в ГУ «Республиканская ветеринарная лаборатория». Для постановки РИД использовали набор для серологической диагностики лейкоза  крупного рогатого скота (ТУ 10-19-442-87), согласно инструкции. Метод основан на обнаружении в сыворотке крови животных специфических преципитирующих антител к антигенам  вируса лейкоза крупного рогатого скота. Специфические антитела появляются в крови через 2 - 8 недель после заражения животного ВЛКРС и сохраняются в организме пожизненно. Молекулярный метод (ПЦР метод) проводили в лаборатории молекулярно-генетической экспертизы УПЦ «БиоВет» ФГБОУ ВПО «КалмГУ». Для выделения ДНК использовали набор «ДНК-сорб-В». Для ПЦР реакции использовали тест-систему «ЛЕЙКОЗ» для выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (bovine leukosis virus) в биологическом материале (ПЦР) Формат FRT: Всего было исследовано 103 образцов крови на наличие антител и провирусной ДНК ВЛКРС. В таблице приведены данные по инфицированности животных различных хозяйств ВЛКРС.

Результаты:

Нами была проведена сравнительная диагностика образцов крови  хозяйств Городовиковского района республики Калмыкия в целях выяснения эффективности диагностических мероприятий и улучшения эпизоотической обстановки района.

Предварительно сыворотку  крови животных исследовали в реакции иммунодиффузии, затем провели молекулярный метод (ПЦР-анализ) исследования. Результаты исследований представлены в Табл.1.

 Таблица 1 

Результаты серологических и молекулярных исследований

По результатам серологических исследований в реакции иммунодиффузии выявлены антитела к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в 75 случаях, что составило 72,8 % встречаемости от числа исследованных. Серонегативными оставались 28 голов или 27,1% встречаемости от числа исследованных.

Молекулярным методом исследования провируса лейкоза крупного рогатого скота выделено присутствие провируса ДНК у 79 животного (ПЦР+), что составило 76,6% встречаемости. У 24 животных по результатам ПЦР диагностики ДНК провирус не детектируется, что составило 23,3% от исследованных животных.

Сравнительный анализ результатов серологических и молекулярно-биологических исследований показывает, что в КФХ Демкин П.В. - ПЦР  исследованием обнаружено на 2 головы больше животных с провирусом ДНК, чем серопозитивных в реакции иммунодиффузии. В п.Шин-Бядл, южный инд. сектор, молекулярный анализ дополнительно выявил одно животное носителя ДНК провируса. В инд. секторе с.Дружное, также обнаружено на 2 носителя ДНК провируса больше, чем животных выявленных по носительству антител. Однако в БАК КГУ гурт Алиева А.М. – ПЦР- исследованием выявлено на одно инфицированное животное меньше, чем при серологической диагностике.

Анализ данных по носительству провируса ДНК, показывает, что процент инфицированных на основании ПЦР-исследований не соответствует проценту РИД-позитивных животных. В 75 случаях выявлено совпадение результатов РИД и ПЦР. При этом ПЦР метод на 4 случая выявил больше носителей ДНК провируса, чем серологическое исследование.

Из шести случаев несовпадения серологических и молекулярных методов исследования один РИД положительный случай ПЦР диагностикой не подтвердился, и пять случаев выявления ПЦР положительного случая, РИД не выявила антитела к вирусу.

Выводы:

Таким образом, ПЦР-исследование выявило на 4 случая больше носителей провируса ДНК, следовательно, если проводить разделение телочек методом ПЦР на носителей провируса и здоровых впервые 2-3 недели жизни животного, можно оздоравливать хозяйства значительно быстрее. Молекулярный метод позволяет провести раннюю диагностику инфицированности, как взрослых животных, так и молодняка и определить их в категорию откормочных животных.

Однако молекулярные методы исследований сдерживаются из-за высокой стоимости  оборудования и реактивов для проведения ПЦР анализа. Полученные нами данные показали высокую чувствительность реакции иммунодиффузии. Серологические методы на сегодня остаются решающими в проведении оздоровительных мероприятий.

Список литературы

1.     Генджиева О.Б. Эффективность оздоровительных мероприятий при лейкозе крупного рогатого скота на территории Республики Калмыкия // Веткорм. 2010. № 3. С. 22-24.

2.     Генджиева О.Б., Гулюкин М.И. Эпизоотология лейкоза в мясном скотоводстве Республики Калмыкия. -«Ветеринария», №7. 2012. С. 23-26.

3.     Гулюкин М.И., Иванова Л.А., Замараева Н. В.,. Грек К. П. Практика оздоровления хозяйств от лейкоза крупного рогатого скота в Российской Федерации / // Ветеринарна медицина:

4.     Гулюкин М.И., Иванова Л.А., Генджиева О.Б., Козырева Н.Г. Генотипирование изолятов ВЛКРС, распространенных на территории республики Калмыкия, Ветеринария Кубани, № 4 ,2012. с

5.     Гулюкин М.И., Иванова Л.А., Замараева Н.В., Баркова Н.В., Грек К.П., Храмцов В.В., Донченко А.С. Разработка эффективных мероприятий против лейкоза крупного рогатого скота. Ветеринария. 2007. № 12. С.- 3.

6.     Донник И.М. Региональная молекулярно - генетическая структура вируса лейкоза крупного рогатого скота. И.М. Донник, А.Т. Татарчук, А.В. Лысов, МЛ. Михеев. Ветеринария Кубани. - Краснодар, 2010. №3. С.- 5- 6.

7.     Ковалюк Н.В. Возможные пути снижения заболеваемости крупного рогатого скота лейкозом в Краснодарском крае. Н. В. Ковалюк. Ветеринария Кубани. 2004. № 4. С. -7–8.

8.     Козырева Н.Г. Совершенствование диагностики ВЛКРС инфекции у телят. Н.Г. Козырева, Л.А. Иванова, М.И. Гулюкин. Ветеринария и Кормление. – 2013. – N1. – С. 16-17.

9.     Макаров В.В. ПЦР в диагностике вируса лейкоза крупного рогатого скота. В.В. Макаров, Д.П. Гришанин. Ветеринария. 2005. №4. С.- 9 - 11.

10. Мандыгра Н.С. Эпизоотологическое значение прижизненной диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Ветеринария, 2000. №6. С.-17-17.

11. ―Методическими указаниями по диагностике лейкоза крупного рогатого скота ‖(2000г.).

12. Нахмансон В.М. Система противолейкозных мероприятий Эпизоотологическая оценка серологического метода диагностики // Ветеринарная газета. – 1997. – № 3. – С 3.

13. Прохватилова Л.Б. Применение ПЦР для раннего обнаружения провируса лейкоза крупного рогатого скота у экспериментально инфицированных животных / Л.Б. Прохватилова, С. Н. Колосов, А. И. Ломакин, В. В. Дрыгин и др. // Ветеринария. – 2001. – № 8. – С. 17-21.

14. Спивак Н.Я. Сравнительный  аспект серодиагностики лейкемии крупного рогатого скота иммуноферментным анализом и реакцией иммунодиффузии в агаре / Н.Я. Спивак, Л.А. Ганова, Г.Е. Раевская, В.Г. Пилипенко и др. // Ветеринарна медицина. Харков, 2005. – № 85. – Т. – 2. – С. 1295-1299.

15. Asfaw Y. Distribution and superinfection of bovine leukemia virus genotypes in Japan/TsudukuS.. Konishi M. etal.//Arch. Virol. - 2005. - N150. - P. 493-505.

16. Felmer R. G. Molecular analysis of a 444 bp fragment of the BLV gp51 env gene reveals a high frequency of non- silent point mutations and suggest the presence of two subgroups of BLV in Chile//J. Vet. Microb. - 2005. - N108.- P. 39-47.

17. Gillet N.. Florins A.. Boxus M. С Burteau. Nigra A.. Vandermeers F. Balon H.. Bouzar A.B.. DefoicheJ.. BurnyA.. ReichertM.. Kettmann R.. Willems L. Mechanisms of leukemogenesis induced by bovine leukemia virus: prospects for novel anti-retroviral therapies in human//J. Retroviral. - 2007. - N4. - P.18-50.