CЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ИНФЕСТАЦИЙ ORNITHODOROS ERRATICUS В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Введение.

Африканская чума свиней (АЧС) - природно-очаговая вирусная болезнь домашних и диких свиней, вызываемая ДНК-содержащим вирусом, рода Asfivirus [9]. АЧС относится к опасным болезням животных и характеризуется сверхострой, острой, подострой, хронической и инаппарантной формами течения [1, 5]. Распространение АЧС вызывает существенные потери в свиноводческой отрасли: усреднённый общий ущерб на один очаг в 2010 году составил более 37 млн. рублей, общий экономический ущерб от АЧС за 2008-2014 года составил 23,602 млрд. рублей. [3,7].

Резервуаром вируса АЧС могут являться клещи семейства Argasidae, подсемейства Ornithodorinae рода Ornithodoros. В семейство Argasidae входят мягкие беспанцирные паразитоформные клещи [2]. Занос АЧС в южные регионы Российской Федерации предопределил необходимость экспериментальной оценки потенциальной роли клещей как вектора и природного резервуара инфекции. Изучение экологии и эпизоотологии болезни даст возможность для осуществления эффективных мер контроля её распространения в условиях отсутствия безопасной вакцины. Для этого необходимо, в том числе, определить вероятность формирования энзоотичных очагов с участием домашних свиней и аргасовых клещей. На данный момент в доступной литературе отсутствуют данные об успешном  сборе клещей рода Ornithodoros  в неблагополучных по АЧС регионах Российской Федерации. Классические прямые методы сбора жёстких клещей (на «флажки») или сбора с животных-хозяев во время питания тяжело применить для сбора клещей рода Ornithodoros, так как аргасовые клещи большую часть времени находятся в своих подземных жилищах и питаются на хозяине преимущественно в ночное время только в течение нескольких часов [4].

Для сбора мягких клещей используют другие прямые способы обнаружения клещевых инвазий, например, отлов клещей с использованием ловушек с сухим льдом. Кроме того, для анализа наличия аргасовых клещей используются специальные иммунологические исследования, основанные на выявлении антител, продуцируемых в результате взаимодействия макроорганизмов клеща и инфестированной свиньи.

Во время эпизоотии вируса АЧС в Испании проведены масштабные исследования сывороток крови инфицированных свиней в твёрдофазном иммуноферментном анализе (ТФ ИФА) на наличие антител к антигенам белков клещей вида O. еrraticus. В результате этих исследований достоверно установлено наличие связи между высокими показателями в сыворотках крови антител к антигенам белков клещей данного вида и присутствием клещей O. еrraticus на фермах [10].

Материалы и методы.

Серологические исследования проводили с помощью тест-системы иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления антител к белку клещей O. еrraticus (центр ветеринарного надзора мадридского университета, VISAVET). Тест система основана на использовании экстракта слюнной железы данного вида клещей в качестве антигена.

В ходе проведения исследования планшеты с сенсибилизированным препаратом экстракта слюнной железы размораживали, промывали фосфатно-буферным раствором с добавлением 0,05% твин 20 (ФБР-т) два раза. Вносили испытуемые и контрольные сыворотки свиней по 0,1 см3 в разведении 1:300 в ФБР-т и инкубировали в течение 1 часа при 37ºC. Исследования проводили в двух повторностях. Через 1 час лунки с сыворотками отмывали 5  раз раствором ФБР-т. Добавляли по  0,1 см3 на лунку анти-свинного конъюгата в разведении 1: 4.500 в ФБР-т и инкубировали в течение 45 минут  при 37ºС. Отмывали  5 раз и добавляли коммерческий субстратный раствор (3,3′,5,5′-Тетраметилбензидин, производство Sigma-Aldrich) по 0,1 см3 на лунку. Инкубировали при 24ºС в течение трёх минут и добавляли 3N серную кислоту по 0,1 см3 на лунку. Оптическую плотность измеряли при длине волны 450 нм.

Отлов клещей производили с помощью ловушек с «сухим льдом». Ловушки представляли из себя открытые пластиковые емкости (глубиной 15-20 см) с гладкой внутренней поверхностью. Под размер этих емкостей, готовили углубления в грунте таким образом, чтобы кромка емкости была на одном уровне с поверхностью установки ловушки.

Внутрь установленной емкости помещали открытый контейнер меньшего объема, наполненный гранулами «сухого льда». Клещи, привлеченные испарением двуокиси углерода, соскальзывали внутрь ловушки и не имели возможности из нее выбраться.

Все ловушки устанавливали в вечернее время, как рядом, так и внутри помещений для содержания свиней. Визуальный учет и сбор «пойманных» клещей осуществляли на следующее утро.

Морфологическое определение собранных видов клещей проводили в лабораторных условиях. Для этого готовили препараты клещей на предметных стеклах, которые рассматривали при помощи инвертированного микроскопа с увеличением в 60 раз. Систематизацию собранных клещей проводили на основании данных, представленных в моногорафии «Фауна СССР - паукообразные» [6].

Результаты исследований. В подведомственном Россельхознадзору ФГБУ «ВНИИЗЖ» регулярно проводятся исследования сывороток крови от свиней из разных регионов РФ на обнаружение антител к возбудителям инфекционных болезней (АЧС, КЧС и др.). Помимо этого в референтной лаборатории по АЧС ФГБУ «ВНИИЗЖ» совместно с сотрудником VISAVET центра проводили исследование упомянутых сывороток крови свиней на наличие антител к белку клещей рода Ornithodoros.

С целью определения наличия серопозитивных к орнитодоринам свиней исследовали 160 проб сывороток крови, отобранных в 2014 году в личных подсобных хозяйствах из разных регионов страны. Результаты исследования представлены в Табл.1.

Таблица 1 Анализ проб сывороток крови свиней на наличие антител к белкам слюнной железы клещей рода Ornithodoros вида Erraticus методом ТФ ИФА

Данные Табл.1 свидетельствуют, что из 160 исследованных сывороток  крови  свиней 18 проб имели антитела к белкам слюнной железы клещей рода O. еrraticus (11,25%). Остальные 142 пробы сывороток крови свиней оказались отрицательными. При этом положительные результаты отмечались преимущественно в пробах сыворотки крови свиней, полученных из южных регионов Российской Федерации, в которых климатические условия являются более благоприятными для жизнедеятельности клещей рода Ornithodoros. Специфичность используемого в исследовании метода не позволяет уверенно говорить о наличии клещей без проведения дополнительных работ по непосредственному обнаружению орнитодоринов [8].

Поэтому на следующем этапе исследований проводили полевые испытания. Были определены свиноводческие хозяйства в Воронежской, Ростовской области и Краснодарском крае, откуда поступили сыворотки крови, оказавшиеся положительными по антителам к орнитодоринам.

В упомянутых хозяйствах, а так же в хозяйствах расположенных в том же географическом районе осуществлены полевые исследования по сбору клещей. Рядом с помещениями  для содержания свиней и  в некоторых случаях внутри этих помещений специалистами ФГБУ «ВНИИЗЖ» однократно устанавливались ловушки с сухим льдом. Всего было установлено по 10 ловушек в указанных регионах. Однако, при учете результатов исследований оказалось, что все отловленные клещи относились к иксодовым, мягких клещей обнаружить не удалось.

Обсуждение и выводы.

Эпизоотическая ситуация по АЧС в Российской Федерации может быть установлена только при полном количественном и качественном изучении участвующих факторов и объектов. Для этого необходимо, в том числе, выявление аргасоносительства у свиней и определение ареала распространения клещей рода Ornithodoros. В ходе проведённых исследований методом ТФ ИФА установлено наличие антител к экстракту слюнной железы клещей O. erraticus в сыворотках крови свиней, полученных из Ростовской, Краснодарской и Воронежской областей Российской Федерации. Проведение предварительной иммунологической диагностики позволяет сузить круг поиска и определить наиболее перспективные для поиска районы и хозяйства. Результаты, полученные в ТФ ИФА, необходимо подтверждать прямым обнаружением клещей. Дополнительно, этот метод может быть адаптирован для использования в качестве контроля дезакаризации.

Отсутствие положительных результатов по выявлению орнитодоринов в обследованных регионах может объясняться и как их отсутствием, так и малой выборкой, краткосрочностью проведенных исследований. Для точного выявления ареала обитания клещей необходимо продолжение таких исследований в более широком масштабе.

Список литературы

1.     Бакулов И.А., Макаров В.В. Проблемы современной эволюции африканской чумы свиней // Вестн. с.-х. науки. – 1990. – № 12. – С. 122-128.

2.     Балашов Ю. С. Кровососущие клещи (Ixodoidea) — переносчики болезней человека и животных // Л. — 1967.

3.     Гулёнкин В.М., Бардина Н.С., Шевцов А.А. Оценка экономического ущерба от африканской чумы свиней // Ветеринария. – 2011. - №10. – С10-12.

4.     Макаров В.В., Сухарев О.И., Литвинов О.Б. Cистема «клещи рода ornithodoros-вирус африканской чумы свиней»: биоэкология, вирусология, эпизоотология // Ветеринарная патология. - 2011. - № 3. - С. 18-29.

5.     Клинико-анатомическое проявление африканской чумы свиней при заражении разными методами вирусом, выделенным от дикого кабана / И. В. Шевченко, С. Г. Ремыга [и др.] // Современные проблемы патологической анатомии, патогенеза и диагностики болезней животных: материалы 18-й  Междунар. научно-методич. конф. - М., 2014.-С.82-84.

6.     Фауна СССР -     паукообразные, Аргасовые  клещи (Argasidae) / Н.А. Филиппова и др.//Издательство «Наука», г. Москва, г. Ленинград 1966г.

7.     Экономические последствия распространения африканской чумы свиней в Российской федерации / В.М. Гулёнкин, И.М. Клиновицкая, А.К. Караулов [и др.] // Ветеринария. – 2015. - № 12. – С 7-11.

8.     African swine fever virus transmission cycles in Central Europe: Evaluation of wild boar-soft tick contacts through detection of antibodies against Ornithodoros erraticus saliva antigen / J. Pietschmann, L. Mur, S. Blome [et all] // BMC Veterinary Research. – 2016. – №12:1. - p. 5.

9.     ICTV Virus Taxonomy: 2014 Release EC 46, Montreal, Canada, July 2014, Email ratification 2015.

10. Detection of pig farms with Ornithodoros erraticus by pig serology. Elimination of non-specific reactions by carbohydrate epitopes of salivary antigens / A. Oleaga-Pérez, R. Pérez-Sánchez, A. Astigarraga [et al.] - Vet Parasitol. – 1994. - № 52. – С. - 97-111.