ПРИМЕНЕНИЕ КЛЕТОЧНО-МОЛЕКУЛЯРНЫХ И ГЕНЕТИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ ПРИ ВЕДЕНИИ БЕРЕМЕННЫХ С РЕЗУС-ОТРИЦАТЕЛЬНОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТЬЮ КРОВИ

Резюме

Представлен собственный клинический опыт неинвазивной пренатальной диагностики резус-фактора плода по крови беременной женщины. Цель исследования: определение аналитических возможностей методики неинвазивного определения резус-фактора плода по крови беременной женщины с использованием наборов реагентов «Тест-RHD плюс», АмплиПрайм ДНК-сорб-Б, Rotor-Gene6000. Материалы и методы: В исследование включены результаты обследования 46 беременных с резус-отрицательной принадлежностью крови, родоразрешенных в БУЗОО «Городской клинический перинатальный центр» г. Омск. На основе полученных данных рассчитаны аналитические возможности методики. Полученные результаты: диагностическая точность – 97,82%, чувствительность – 100%, специфичность – 92,85%, прогностическая ценность положительного результата – 96,96%, прогностическая ценность отрицательного результата – 100%. Выводы: при четком соблюдении условий проведения исследования методика неинвазивного определения резус-фактора плода по крови беременной женщины с использованием набора реагентов «Тест-RHD плюс» (производство ООО "ТестГен", Россия), АмплиПрайм ДНК-сорб-Б (производство ООО "НекстБио", Россия), Rotor-Gene6000 (производство Corbett Research, Австралия) может быть рекомендована к применению в рутинной лабораторной практике.

Ключевые слова: неинвазивная диагностика, резус-фактор, внеклеточная фетальная ДНК, ТестГен.

В последние годы интенсивно разрабатываются неинвазивные методы дородовой диагностики различной наследственной патологии. Риск акушерских осложнений при их проведении существенно ниже, чем при использовании инвазивных методов. Наиболее часто  неинвазивные методы, не требующие забора плодного материала, применяют для диагностики у плода врождённых пороков развития и хромосомных синдромов. В то же время сфера неинвазивной пренатальной диагностики не ограничивается диагностикой генетических особенностей и анеуплоидий плода. Одно из активно развивающихся направлений – это неинвазивное генетическое определение резус-фактора плода у женщин с резус-отрицательной принадлежностью крови [4, 13, 15,18].

До настоящего времени преемственность результатов исследований речь неинвазивной пренатальной диагностики (НИПД) от научных изысканий в клиническую практику была довольно фрагментирована. Успехи в улучшении аналитических характеристик тест-систем, стандартизация протоколов выделения внеклеточной фетальной ДНК (вкфДНК) и последующей ПЦР-амплификации, использование современных ПЦР амплификаторов повысило показатели диагностической точности, чувствительности и специфичности методик и активно способствует их внедрению в рутинную клинико-лабораторную практику [2].

Цель исследования: определить аналитические возможности методики неинвазивного определения резус- фактора плода по крови беременной женщины с использованием тест систем «Тест-RHD плюс» (производство ООО "ТестГен", Россия), АмплиПрайм ДНК-сорб-Б (производство ООО "НекстБио", Россия), Rotor-Gene6000 (производство Corbett Research, Австралия).

Материалы и методы исследования

В исследование включены результаты обследования 46 беременных резус-отрицательной принадлежностью крови, наблюдавшихся и родоразрешенных в БУЗОО «Городской клинический перинатальный центр» (главный врач – Николаев С.В.), г. Омск. Критериями включения явились: резус-отрицательная принадлежность крови беременной; факт беременности, подтвержденный объективными методами; срок гестации более 10 недель, наличие информированного добровольного согласия.

Для экстракции внеклеточной циркулирующей фетальной ДНК из клинического материала применяли комплект реагентов АмплиПрайм ДНК-сорб-Б (производство ООО "НекстБио", Россия). В результате выделения получался высокоочищенный препарат ДНК, свободный от ингибиторов реакции амплификации, обеспечивающий высокую аналитическую чувствительность ПЦР-исследования. Для определения резус-фактора плода методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией использовался набор реагентов «Тест-RHD плюс» (производство ООО "ТестГен", Россия), Амплификатор Rotor- Gene6000 (производство Corbett Research, Австралия).

Для получения плазмы кровь (не менее 8 мл) отбиралась в пробирку с EDTA-антикоагулянтом, последующие отделение плазмы проводилось в течение 3 часов с момента взятия крови. Программа амплификации представлена в таблице 1.

Все реакции сопровождались постановкой отрицательного и положительного контроля (набор «Тест- RHD», ООО «ТестГен», Россия). Результат ПЦР-исследования считались  достоверным, при получении правильных результатов для отрицательных контролей амплификации и положительных контролей амплификации.

Полученные результаты подтверждались серологическим методом исследования крови новорожденного после родоразрешения обследуемой.

Проанализированы аналитические характеристики методики: диагностическая точность, чувствительность, специфичность, положительная прогностическая ценность, отрицательная прогностическая ценность.

Результаты исследования и их обсуждение

По результатам ДНК-анализа 46 образцов крови установлено, что положительный резус-фактор был выявлен в 71,7% (33 образца) случаев, в 28,3% (13 образцов) – резус-фактор плода по данным анализа был отрицательным. Данные результаты были подтверждены серологическим методом исследования резус-фактора у новорожденных. В одном случае отмечено несовпадение результата анализа: при положительном результате по данным тест-системы новорожденный оказался резус-отрицательным, при этом не представлялось возможным уточнить генетический статус плода, проанализировав буккальный соскоб, ввиду отказа пациентки от исследования.

Проанализированы аналитические характеристики методики: диагностическая точность – 97,82%, чувствительность – 100%, специфичность – 92,85%, прогностическая ценность положительного результата – 96,96%, прогностическая ценность отрицательного результата – 100%, Табл.2.

   Таблица 2

Общая характеристика образцов и аналитические параметры методики

Следует особо отметить, что при анализе возможных причин расхождения полученных результатов в указанном случае были установлены нарушения правил транспортировки и хранения материала, таким образом, данный результат не может учитываться при анализе аналитических возможностей данного метода диагностики.

В РФ активно внедряется уже принятая в европейских странах методика Rh(D)-генотипирования плода [7, 16]. Чувствительность данного метода при сроке гестации 10-11 недель, по данным F.B. Clausen, составляет 99,3% [10], по другим сообщениям – 98,7%, специфичность – 100% [11]. Разработаны ДНК-зонды и к другим антигенам эритроцитов: С, Е, К, FYA, JKA, JKB, M, S (Соединенное королевство Великобритания) [9].

Учеными отмечена экономическая эффективность внедрения RHD-генотипирования плода в программу наблюдения и ведения беременных [11]. В Дании определение резус-принадлежности плода по крови матери входит в  стандарты наблюдения и ведения беременных. Данный рутинный дородовый скрининг позволяет отобрать беременных, нуждающихся в проведении плановой профилактики резус-иммунизации в 28-30 недель [12]. Рефересная лаборатория в Бристоле выполняет данные исследования с 2001 года, и в настоящее время выполняет около 200 исследований женщин в год на 26-32 неделях беременности. Дискордантные результаты отсутствуют с 2005 года.

В мировой клинической практике разработаны несколько экономических моделей, позволяющих судить об экономической целесообразности применения вариантов данных моделей для предотвращения резус- иммунизации. Учитывая стоимость проведения исследования, был сделан вывод о том, что проведение плановой иммунопрофилактики остается предпочтительным методом профилактики резус-иммунизации [8]; данная позиция разделяется Итальянским обществом акушеров гинекологов (SIGO) [16]. Кроме того, обсуждается возможность внедрения в повседневную практику RHC/c, RHE/e, KEL генотипирования плода [7]. В Норвегии действует программа скрининга, включающая типирование не только резус-принадлежность плода по крови матери, но и определение тромбоцитарных аллелей HPA-1A, с целью идентификации HPA-1b1b и последующего проведения профилактических мероприятий [4].

В Швеции в 2012 году при внедрении методики в клиническую практику получены следующие результаты: инвазивное определение резус-фактора плода выполнено у 4118 беременных женщин, медиана срока беременности составила 10 недель. Повторный анализ пришлось выполнить в 211 случаях (5,1%). Выявлен положительный резус-фактор плода в 2401 случаев (58,3%), отрицательный в 1552 (37,7%), результаты были неубедительны в 165 (4,0%) наблюдениях после первого тестирования. После повтора анализа 147 образцов из 165 только 14 остались неубедительными, все в результате слабого или неэкспрессирующегося материнского RHD гена. В качестве золотого стандарта для подтверждения резус-фактора новорожденных применялось серологическое определение. Количество ложно-отрицательных результатов составило 55 из 2297 (2,4%), ложно- положительных – 15 из 1355 (1,1%). Чувствительность и специфичность оказались близкими к 99% в образцах после 8 недели беременности. С 22 недели беременности чувствительность составила 100%.

В России многоцентровое исследование неинвазивного определения резус-фактора выполнялось на базе 11 учреждений (Анализ показателей информативности наборов реагентов «Тест-SRY» и «Тест-RHD» при определении пола и резус-фактора плода. Представлены результаты обширных доклинических испытаний наборов реагентов «Тест-SRY» и «Тест-RHD» производства компании «ТестГен» для раннего неинвазивного определения пола и резус-фактора плода по крови беременной женщины. Проведён анализ данных, полученных в ходе мультицентрового исследования на базе 11 лабораторий. В исследовании приняло участие 1817 беременных женщин, 1006 были проанализированы по полу плода и 811 – по резус-фактору плода (все женщины, участвовавшие в анализе резус-фактора  плода,  сами  имели отрицательный резус-фактор).  Установлено,  что методики определения пола и резус фактора плода по крови беременной женщины с применением наборов «Тест- SRY» и «Тест-RHD» (ООО «ТестГен», Россия) обладают высокими показателями диагностической точности, чувствительности и специфичности [3].

Выводы. Методика определения резус-фактора плода по крови женщины на ранних сроках беременности с использованием одно-экзонного метода обладает высокими показателями диагностической точности, чувствительности и специфичности; является простой и надежной в исполнении и может быть рекомендованы для применения в рутинной клинической практике [1].

Список литературы

1.     Маркелова А.Н., Тюмина А.В., Тороповский А.Н. Новый подход к ведению беременных женщин с резус- отрицательной кровью с ранних сроков беременности. Фундаментальные исследования. 2011; 11:2:330- 332.

2.     Ожерельева М.А., Кравченко Е.Н., Куклина Л.В. Резус-сенсибилизация, гемолитическая болезнь плода и новорожденного. Современные тенденции и перспективы. Акушерство и гинекология. 2015; 12:16-20.

3.     Тороповкий А.Н., Никитин А.Г., Жмырко Е.В., Скороходов Л.С., Беляков А.В., Викторов Д.А. Анализ показателей информативности наборов реагентов «ТЕСТ-SRY» И «ТЕСТ-RHD» при определении резус- фактора плода. Фундаментальные исследования. 2014; 10:1566-1571.

4.     Avent N. D. Prenatal testing for hemolytic disease of  the newborn and fetal neonatal alloimmune thrombocytopenia – current status. Rev. Hematol. 2014; 7: 6:741-750. doi: 10.1586/17474086.2014.970160.

5.     Bennardello F., Curciarello G. Survey on the prevention and incidence of haemolytic disease of the newborn in Italy. Blood Transfus. 2013; 12:11:518-527. doi: 10.2450/2013.0179-12.

6.     Clausen F.B. Integration of noninvasive prenatal prediction of fetal blood group into clinical prenatal care. Prenat.

Diagn. 2014; 34:5:409-515. doi: 10.1002/pd.4326.

7.     Clausen F.B., Damkjær M.B., Dziegiel M.H. Noninvasive fetal RhD genotyping. Transfus. Apher. Sci. 2014; 50:2:154-162. doi: 10.1016/j.transci.2014.02.008.

8.     Duplantie J., Martinez Gonzales O., Bois A., Nshimyumukiza L., Gekas J., Bujold E., Morin V., Vallée M., Giguère Y., Gagné C., Rousseau F., Reinharz D. Cost-effectiveness of the management of rh-negative pregnant women. J. ObstetGynaecol. 2013; 35:8:730-740.

9.     Finning K., Martin P., Summers J., Daniels G. Fetal genotyping for the K (Kell) and Rh C, c, and E blood groups on cell-free fetal DNA in maternal plasma. Transfusion. 2007; 47:11:2126-2133.

10. Geifman-Holtzman O., Grotegut C.A., Gaughan J.P. Diagnostic accuracy of noninvasive fetal Rh genotyping from maternal blood – a meta-analysis. Am. J. Obstet. Gynecol. 2006; 195:4:1163-1173.

11. Gönenç G., Işçi H., Yiğiter A.B., Hançer V., Büyükdoğan M., Güdücü N., Dünder I. Non-invasive prenatal diagnosis of fetal RhD by using free fetal DNA. Clin. Exp. Obstet Gynecol. 2015; 42:3:344-360.

12. Guinchard E., Bricca P., Monnier S., Rigal D. Non-invasive fetal RHD genotyping: Validation of the method with 200 patients. Transfus. Clin. Biol. 2014; 21:1:1-14. doi: 10.1016/j.tracli.2013.12.001.

13. Guinchard E., Bricca P., Monnier S., Rigal D. Non-invasive fetal RHD genotyping: Validation of the method with 200 patients. Transfus. Clin. Biol. 2014; 21:1:1-14. doi: 10.1016/j.tracli.2013.12.001.

14. Kent J., Farrell М., Soothill Р. Routine administration of Anti-D: the ethical case for offering pregnant women fetal RHD genotyping and a review of policy and practice. BMC  Pregnancy Childbirth. 2014; 14:87. doi: 10.1186/1471-2393-14-87.

15. Klein H., Anstee D. Hemolytic disease of the fetus and newborn. Blood Transfusion in Clinical Medicine. 2005; 5:496-545.

16. Manzanares S., Entrala C., Sánchez-Gila M., Fernández-Rosado F., Cobo D., Martinez E., Molina L., Reche R., Pineda A., Gallo J.L. Noninvasive fetal RhD status determination in early pregnancy. Fetal Diagn. Ther. 2014; 35:1:7-12. doi: 10.1159/000356078.