04 февраля 2018г.
Аннотация
Цель работы - исследование участия сигнальных путей, связанных с выживанием клеток (NFKB-, AKT-, ERK-опосредованные каскады), в регуляции апоптоза нейронов гипоталамуса при физиологическом и патологическом (сверхэкспрессия онкогена HER2/neu) старении. Изучены HER2/neu-трансгенные ускоренно стареющие мыши, дикий тип – линия FVB/N. Оценивали уровень апоптоза нейронов (TUNEL) и экспрессию факторов NFKB, p-ERK, p-AKT и TNF alpha (Western blotting). Показано, что у мышей дикого типа TNF-a, вероятно, выполняет антиапоптотическую роль, поскольку его снижение на поздних этапах онтогенеза обратно соотносится с уровнем апоптоза нейросекреторных клеток гипоталамуса. Сигнальные каскады АКТ, ЕRK и NFKB не играют заметной роли в механизмах возраст-зависимого апоптоза у мышей линии FVB/N. Резистентность клеток к апоптозу при старении у трансгенных мышей, обусловленная сверхэкспрессией онкогена HER2/neu, обеспечивается сочетанием различных путей выживания (NFKB, p- ERK, p-AKT и TNF alpha).
Ключевые слова: апоптоз, старение, нейроны, гипоталамус, супраоптическое ядро, паравентрикулярное ядро, HER2/neu, NFKB, TNF alpha, ERK, AKT.
THE ROLE OF NFKB, AKT, ERK SIGNAL CASCADE IN REGULATION OF APOPTOSIS OF HYPOTHALAMUS NEURONS IN AGING
Bazhanova E.D.
Federal State Budgetary Institution of Science Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Russian Academy of Sciences, St. Petersburg, Russia, Astrakhan State University, Astrakhan, Russia
Annotation
The aim of the study is the involvement of signaling pathways associated with cell survival (NFKB-, AKT-, ERK-mediated cascades) in the regulation of apoptosis of the hypothalamus neurons in the physiological and pathological (overexpression of the oncogene HER2/neu) aging. HER2/neu transgenic accelerated aged mice were studied, wild type - FVB/N line. Neuronal apoptosis level (TUNEL) and expression of NFKB, p-ERK, p-AKT, and TNF alpha factors were assessed (Western blotting). It is shown that in wild type mice, TNF-a probably performs an antiapoptotic role, since its decrease at late stages of ontogeny is inversely related to the level of apoptosis of neurosecretory cells of the hypothalamus. AKT, ERK and NFKB signaling cascades do not play a significant role in age-related apoptosis in FVB/N line mice. Cell resistance to apoptosis in aging in transgenic mice due to overexpression of the HER2/neu oncogene provides combinations of various survival ways (NFKB, p-ERK, p-AKT and TNF alpha).
Key words: apoptosis, aging, neurons, hypothalamus, supraoptic nucleus, paraventricular nucleus, HER2/neu, NFKB, TNF alpha, ERK, AKT.
Введение
Старение связано с системным воспалением и клеточным апоптозом, индуцированным появляющимися физиологическими дисфункциями [2]. Многие факторы, участвующие в регуляции инфламматорных процессов, также играют важную роль в механизмах апоптоза, это, например, фактор некроза опухолей tumor necrosis factor alpha, TNF-a. Проинфламматорный белок TNF-a является цитокином, регулирующим множество биологических процессов. Ранее считалось, что TNF-a является проапоптотическим фактором [3, 9], однако в настоящее время показано, что он выполняет антиапоптотическую роль [4, 5], либо участие его в апоптозе зависит в каждом конкретном случае от биохимического и физиологического состояния клетки [6, 8]. Показано, что TNF-a способен индуцировать фосфорилирование ERK-сигнального пути, зависящего также от уровня экспрессии ростовых факторов и их рецепторов (EGF/EGFR). EGF/EGFR система приводит к активации внутриклеточных киназных каскадов, таких, как PI3K/AKT и NFKB [1]. EGF-опосредованная активация PI3K/AKT и NFKB выполняет антиапоптотические функции [7]. Как известно, HER2 является тирозинкиназным рецептором эпидермального фактора роста, и его мишенями являются ERK и AKT сигнальные пути. Целью данной работы является исследование участия сигнальных путей, связанных с выживанием клеток (NFKB-, AKT-, ERK-опосредованные каскады), в регуляции апоптоза нейронов гипоталамуса при физиологическом и патологическом (сверхэкспрессия онкогена HER2/neu) старении.
Материалы и методы
Мы исследовали HER2/neu-трансгенных ускоренно стареющих мышей-самок разного возраста (2, 10 мес), дикий тип – линия FVB/N (2, 18 мес). Материал для исследования - нейросекреторные центры гипоталамуса (супраоптическое (СОЯ) и паравентрикулярное (ПВЯ) ядра). Оценивали уровень апоптоза нейронов (TUNEL) и экспрессию членов сигнальных путей выживания NFKB, p-ERK и p-AKT, а также TNF alpha (Western blotting) c последующей денситометрией (ImageJ). Полученные данные были обработаны с использованием критерия Стьюдента (p< 0,05) с помощью программы Microsoft Excel 2007.
Результаты и обсуждение
У мышей дикого типа в СОЯ нет изменений в уровне синтеза TNF-a, в ПВЯ наблюдается снижение экспрессии данного фактора. У cтарых трансгенных мышей в СОЯ отмечена тенденция к усилению экспрессии TNF-a, по сравнению с молодыми, тогда как в ПВЯ нет возрастной динамики. При этом у старых HER2/neu мышей экспрессия TNF-a значительно превышает данный показатель у мышей дикого типа в обоих нейросекреторных центрах.
Экспрессия NFKB у мышей линии FVB/N на поздних этапах онтогенеза снижается (значительно в СОЯ и тенденция к снижению в ПВЯ). При этом в гипоталамусе старых мышей данной линии нет изменений в содержании фосфорилированных форм AKT и ERK (p-AKT, p-ERK).
У трансгенных животных уровень синтеза NFKB при старении снижается в СОЯ и увеличивается в ПВЯ. Нужно заметить, что у старых HER2/neu мышей экспрессия данного фактора значительно больше в обоих ядрах гипоталамуса, чем у мышей дикого типа. Подобные изменения отмечены в отношении содержания р-АКТ – снижение в СОЯ, но отсутствие динамики в ПВЯ при старении. Уровень р-ЕRK, напротив, возрастает в СОЯ старых HER2/neu мышей, не изменяясь в ПВЯ.
Таким образом, можно предположить, что у мышей дикого типа TNF-a выполняет антиапоптотическую роль, поскольку его снижение на поздних этапах онтогенеза обратно соотносится с уровнем апоптоза нейросекреторных клеток гипоталамуса. Очевидно, что хорошо известные пути выживания – сигнальные каскады АКТ и ЕRK – не играют заметной роли при старении у мышей линии FVB/N, то же можно сказать о NFKB-зависимом пути.
У старых трансгенных животных уровень TNF-a достоверно выше в обоих изученных ядрах, чем у мышей дикого типа. Возможно, данный фактор играет важную роль в обеспечении устойчивости клеток к апоптозу у мышей при сверхэкспрессии онкогена HER2/neu. Результаты наших экспериментов показали, что регуляция апоптоза при патологическом старении осуществляется по-разному в разных нейросекреторных центрах гипоталамуса. В СОЯ старых трансгенных животных, помимо TNF-a, повышается содержание р- ЕRK, в ПВЯ – увеличивается синтез TNF-a, NFKB и р-АКТ.
Таким образом, резистентность клеток к апоптозу при старении у трансгенных мышей, обусловленная сверхэкспрессией онкогена HER2/neu, обеспечивается не одним фактором, а сочетанием различных факторов, различных путей выживания.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект 15-04-00425).
Список литературы
1. Anest V, Cogswell PC, Baldwin AS Jr IkappaB kinase alpha and p65/RelA contribute to optimal epidermal growth factor-induced c-fos gene expression independent of IkappaBalpha degradation. J Biol Chem 2004. 279:31183–31189.
2. Kangas R, Törmäkangas T, Heinonen A, Alen M, Suominen H, Kovanen V, Laakkonen EK, Korhonen MT. Declining Physical Performance Associates with Serum FasL, miR-21, and miR-146a in Aging Sprinters. Biomed. Res. Int. 2017. 8468469. doi: 10.1155/2017/8468469.
3. Lam C-S, Tipoe GL, So K-F, Fung M-L. Neuroprotective Mechanism of Lycium barbarum Polysaccharides against Hippocampal-Dependent Spatial Memory Deficits in a Rat Model of Obstructive Sleep Apnea. PLOS ONE. 2015. DOI:10.1371/journal.pone.0117990.
4. Lee C-W, Lin C-C, Lin W-N, Liang K-C, Luo S-F, Wu C-B, Wang S-W, Yang C-M. TNF- induces MMP-9 expression via activation of Src/EGFR, PDGFR/PI3K/Akt cascade and promotion of NF-B/p300 binding in human tracheal smooth muscle cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2007. 292: L799–L812.
5. Lisi S, Sisto M, Ribatti D, D’Amore M, De Lucro R, Frassanito MA, Lorusso L, Vacca A, Lofrumento DD. Chronic inflammation enhances NGF-β/TrkA system expression via EGFR/MEK/ERK pathway activation in Sjögren’s syndrome. J. Mol. Med. 2014. 92:523–537. DOI 10.1007/s00109-014-1130-9.
6. Micheau O, Shirley S, Dufour F. Death receptors as targets in cancer. British Journal of Pharmacology. 2013. 169; 1723–1744.
7. Nakamura H, Kawakami A, Ida H, Koji T, Eguchi K EGF activates PI3K-Akt and NF-kappaB via distinct pathways in salivary epithelial cells in Sjögren’s syndrome. Rheumatol Int 2007. 28:127– 136.
8. Nishimura M, Shin M-S, Singhirunnusorn P, Suzuki S, Kawanishi M, Koizumi K, Saiki I, Sakurai
H. TAK1-Mediated Serine/Threonine Phosphorylation of Epidermal Growth Factor Receptor via p38/Extracellular Signal-Regulated Kinase: NF-B-Independent Survival Pathways in Tumor Necrosis Factor Alpha Signaling. Mol. Cell. Biol. 2009. 29(20):5529–5539. 0270- 7306/09/$08.00_0 doi:10.1128/MCB.00375-09
9. Papa S, Zazzeroni F, Pham CG., Bubici C, Franzoso G. Linking JNK signaling to NF-kB: a key to survival. J Cell Science 2004. 117, 5197-5208, doi:10.1242/jcs.01483
