Москва
22 января 2017г.
Поиск продуцентов коллагеназ представляет несомненный интерес для различных областей жизнедеятельности человека. Указанные ферментымогут использоваться в медицинской практике, косметологии, пищевой промышленности [2]. Ранее нами были разработаны подходы, позволяющие осуществлять поиск продуцентов коллагенази разработать методы их выделения[3, 4]. Использование при скрининге модифицированных субстратов, обладающих повышенной устойчивостью к протеолизу, является дополнительным критерием при отборе потенциальных продуцентов [1, 5].Целью настоящей работы являлся поиск новых продуцентов коллагеназ с использованием модифицированного и немодифицированного коллагена.
Культуры Aspergillusmangini, Penicilliummartensii, Penicilliumroqueforti, Penicilliumsteckii, Penicilliumvitale выращивали на скошенной поверхности агаризованной среды Чапека следующего состава (%): NaNO3 – 0,2; KH2PO4 - 0,1; MgSO4 x 7H2О – 0,05; KCl – 0,05; FeSO4x 7H2O – 0,001; CaCO3 – 0,3; сахароза – 2; агар – 2, (рН 6,8) в течение 7-ми суток в термостате при 260С. Для проведения поверхностного культивирования использовали агаризованные среды, содержащие солевой фон среды Чапека с заменой сахарозы на 2% нативного и модифицированного коллагена, полученного так, как это было описано нами ранее [4]. Протеолитическую способность микроорганизма оценивали по диаметру колоний на соответствующих субстратах после посева микромицетана агаризованную среду. Активность биосинтеза ферментов оценивали по индексу лизиса (Iлиз): Iлиз = R2лиз /R2кол, где Rлиз – радиус зоны лизиса, Rкол – радиус колонии.
Таблица 1 Параметры роста культур при поверхностном культивировании на средах, содержащих различные субстраты
|
Культура
|
Субстрат
|
Время культивирования, сутки
|
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
10
|
|
Dк,
мм
|
Dл,
мм
|
Dк,
мм
|
Dл,
мм
|
Dк,
мм
|
Dл,
мм
|
Dк,
мм
|
Dл,
мм
|
Dк,
мм
|
Dл,
мм
|
Dк,
мм
|
Dл,
мм
|
|
A. mangini
|
кн
|
11,2
|
19
|
14,5
|
28,5
|
18
|
32,3
|
21,8
|
40
|
21,3
|
55
|
ин
|
ин
|
|
км
|
9,5
|
0
|
13,2
|
0
|
16,5
|
20
|
21,8
|
25,8
|
24,5
|
32,2
|
30,5
|
47,3
|
|
P. martensii
|
кн
|
12,1
|
20
|
17,2
|
27
|
21,7
|
36,7
|
26
|
41,3
|
28,2
|
48,8
|
30,2
|
ин
|
|
км
|
8,7
|
0
|
12,7
|
0
|
14,8
|
16,3
|
20,8
|
24,7
|
23,5
|
32,3
|
29,7
|
44,7
|
|
P. roqueforti
|
кн
|
11
|
16,7
|
15,5
|
27,2
|
19
|
34,2
|
23,8
|
39,5
|
25,8
|
45
|
30
|
ин
|
|
км
|
8,7
|
0
|
12,8
|
14,7
|
16,7
|
19,7
|
20,7
|
24,3
|
21,7
|
29,5
|
25,2
|
44
|
|
P. steckii
|
кн
|
14,8
|
17,0
|
19,7
|
21,3
|
24,7
|
31,5
|
29,8
|
41
|
35
|
45,8
|
46
|
67
|
|
км
|
9,8
|
0
|
13,7
|
0
|
18,5
|
0
|
25,2
|
27,5
|
29,2
|
32,8
|
38,8
|
49,3
|
|
P. vitale
|
кн
|
15,8
|
16,8
|
21,2
|
23,5
|
25
|
27,3
|
27,3
|
27,3
|
28,8
|
28,8
|
39,2
|
39,2
|
|
км
|
2
|
0
|
6
|
0
|
12,3
|
0
|
20
|
0
|
23
|
0
|
36
|
0
|
Примечание. Здесь и в других таблицах использованы следующие обозначения: Dк – диаметр колоний; Dл – диаметр зон лизиса; кн – нативная коллаген; км – модифицированный коллаген; ин – исследования не проводились.
Результаты исследования роста микромицетов при культивировании на различных средах приведены в таблице 1. Культура A. mangini росла значительно медленнее на среде, содержащей модифицированный коллаген, особенно на начальных этапах роста. Значительно позднее начали образовываться и зоны лизиса. При этом диаметр зон лизиса при культивировании на модифицированном субстрате был меньше в 1,5 – 1.7 раза. Исследования на 10 сутки на среде с нативным коллагеном не проводились, так как колонии слились. Скорости роста культурыP. martensiiна средах, содержащих модифицированный и нативный коллаген, отличались примерно в такой же степени, как и в случае первой культуры.
Аналогичные закономерности наблюдались и при культивировании P. steckii (табл. 1). При этом зоны лизиса на модифицированном субстрате образовывались на сутки позднее, и их размер был меньше зон лизиса на нативном коллагене в 1,2 – 1,4 раза. Однако необходимо отметить, что размер колоний при росте на обеих средах у этой культуры был наибольшим среди других исследованных дейтеромицетов.
Очень небольшие различия размеров зон лизиса при росте на модифицированных и немодифицированных средах, отмечались и при культивировании P. roqueforti. В некоторых случаях диаметры зон лизиса на модифицированном коллагене были сравнимы с теми же показателями, что и при росте на нативномсубстрате (табл. 1). Кроме того, образование зон лизиса на модифицированной среде начиналось на более ранних сроках (4 сутки культивирования), чем у всех остальных культур.
Наибольшие различия при росте на указанных субстратах наблюдались у культуры P. vitale. Зоны лизиса на модифицированном коллагене отсутствовали на всех этапах культивирования. При этом был значительно замедлен и рост колоний, особенно на начальных этапах (табл. 1).
Индекс лизиса является интегральным показателем, который свидетельствует о способности культуры секретировать протеолитические ферменты, гидролизующие соответствующий субстрат. В процессе проведенного исследования выявлено (табл. 2), что у всех микромицетов индексы лизиса были существенно ниже при росте на модифицированном белке и регистрировались на более поздних этапах культивирования. При этом у P. vitaleотсутствовали видимые зоны лизиса на модифицированном коллагене, и индексы лизиса на нативном субстратебыли очень небольшими.
Таблица 2
Индексы лизиса при росте на нативном и модифицированном коллагене
|
Субстрат
|
Куль-
тура
|
Время культивирования, сутки
|
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
10
|
|
кн
|
A.mangini
|
2,9
|
3,7
|
3,2
|
3,4
|
6,7
|
ин
|
|
км
|
0
|
0
|
1,5
|
1,4
|
1,7
|
2,4
|
|
кн
|
P.roqueforti
|
2,3
|
3,1
|
3,3
|
2,8
|
3,0
|
ин
|
|
км
|
0
|
1,3
|
1,4
|
1,4
|
1,8
|
3,0
|
|
кн
|
P.steckii
|
1,3
|
1,2
|
1,6
|
1,9
|
1,7
|
2,1
|
|
км
|
0
|
0
|
0
|
1,2
|
1,3
|
1,6
|
|
кн
|
P.martensii
|
2,7
|
2,5
|
2,9
|
2,5
|
3,0
|
ин
|
|
км
|
0
|
0
|
1,2
|
1,4
|
1,9
|
2,3
|
|
кн
|
P.vitale
|
1,1
|
1,2
|
1,20
|
0
|
0
|
0
|
|
км
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
0
|
Максимальный индекс лизиса на нативном коллагене отмечался у A. mangini на 7 сутки культивирования (6,7) и был выше максимального индекса лизиса у других культур в 2,0 – 5,6 раза.
Относительно высокий индекс лизиса отмечался также P. roquefortiи P. martensii.При росте на модифицированном белке максимальный индекс лизиса зарегистрирован для P. roquefortiна 10 сутки. У A. mangini и P. martensii указанный показатель был ниже на 20 и 24% соответственно.
Комплексное изучение диаметров колоний, зон лизиса и индексов лизиса при поверхностном культивировании 5 микромицетов на средах с нативным и модифицированным коллагеном показало, что наибольшим протеолитическим потенциалом обладают культурыP.roqueforti,A.mangini и P. martensii.Указанныекультурыперспективныдляиспользованиявкачествепродуцентовколлагеназ.
Список литературы
1 .Гордонова И.К., Никитина З.К. Оценка протеолитической активности мицелиальных грибов – потенциальных деструкторов белковых субстратов // Сборник научных трудов по итогам международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы естественных и математических наук в современных условиях развития страны», выпуск III, С-Петербург, 11 января 2016 г., с. 56-59.
2 .Демина Н.С., Лысенко С.В. Коллагенолитические ферменты, секретируемые микроорганизмами (Обзор) // Микробиол. – 1996; 65(3): 293-304.
3 .Сухосырова Е.А., Никитина З.К., Яковлева М.Б., Вещикова Е.В., Быков В.А. Характеристика коллагенолитических ферментов, секретируемых дейтеромицетомAspergillusflavus. // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 2003. Т. 35. №5. С. 526-530.
4 .Яковлева М.Б., Зон Х.Ч., Никитина З.К., Быков В.А. Рост и синтез внеклеточных ферментов некоторыми видами дейтеромицетов, культивируемых на различных белковых субстратах // Вопросы биол., медиц. и фармацевтич. химии. – 2009; 1: 6-10.
5.Gordonova I.K., Nikitina Z.K. Search of proteinases secreting deuteromyces.Materials of the X International research and practice conference "Science, Technology and Higher Education", Canada, April 28-29, 2016. P.111-118.
|
