12 марта 2016г.
Мембранотропные гомеостатические тканеспецифические биорегуляторы (МГТБ) представляют собой новую группу внеклеточных биорегуляторов, имеющих сложное строение, основу которых представляют пептидно-белковые комплексы. Из-за сходства физико-химических свойств и характера биологической активности они были объединены в отдельную группу [10, 11]. В настоящее время МГТБ найдены в различных тканях позвоночных животных, растений [7] и в грибах [2]. МГТБ оказывают влияние на основные биологические процессы – клеточную адгезию, пролиферацию, миграцию и дифференцировку, причем их биологическое действие характеризуется проявлением тканевой, но не видовой специфичности. Важным свойством этих биорегуляторов является их способность проявлять свою активность в растворах низких концентраций, соответствующих 10-8 - 10-15 мг белка. Было установлено, что МГТБ способствуют увеличению жизнеспособности клеток при культивировании in vitro, а также стимулируют процессы восстановления и репарации в травмированных и патологически измененных тканях [10, 11]. Так, например, биорегуляторы, выделенные из сыворотки крови и листа подорожника большого, демонстрируют ранозаживляющее действие в условиях экспериментальной травмы кожи in vivo [5, 6], а МГТБ, выделенный из печени крыс, способствовал активации пигментированных клеток печени у амфибий in vitro [9]. Пигментированные клетки печени амфибий (аналоги Купферовых клеток печени млекопитающих) функционируют как макрофаги, поглощая различные частицы, например, микроорганизмы, вирусы, а также осуществляют детоксикацию различных ксенобиотиков [3]. Дополнительная активация пигментированных клеток (увеличение их количества и миграции с образованием клеточных кластеров) обусловлена условиями содержания амфибий и зависит, например, от сезона, от воздействий повреждающих факторов на животное – интоксикации, гипоксемии, травм и отражает защитную реакцию организма, выражающуюся в образовании больших кластеров этих клеток, локализованных в кортикальном слое и околососудистых пространствах – зонах кроветворения, а также присутствуют в паренхиме печени [4, 14]. Биорегуляторы, выделенные из печени крыс, а также культуральной среды гриба Fusarium sambucinum и гепатопанкреаса камчатского краба, способствовали образованию крупных кластеров пигментированных клеток в печени тритона при роллерном органотипическом культивировании in vitro, то есть, стимулировали защитные функции железы амфибии [1, 2, 9]. В настоящей работе предпринята попытка изучить действие данных биорегуляторов на модели CCl4 -индуцированного фиброза в печени у крыс in vivo.
Материалы и методы.
Биорегуляторы выделяли из тканей и культуральной среды микомицелия Fusarium s., согласно ранее разработанной методике [11]. Тканевые экстракты получали из следующих источников: печень крыс Wistar обоего пола, весом 200 – 250 г; ткань гепатопанкреаса краба камчатского, предварительно подвергнутую глубокой заморозке; культуральную среду гриба Fusarium s. [9]. Печень крыс после декапитации животных под эфирным наркозом перфузировали охлажденным до 4°С раствором Рингера (6,5 г NaCl, 0,42 г KCl и 0,25 г CaCl2 в 1 литре воды), нарезали на мелкие фрагменты и экстрагировали р-ром Рингера при 4°С в течение 2-3 часа. После центрифугирования в тканевой экстракт добавляли сухой сульфат аммония до образования насыщенного раствора (780 г/литр) и оставляли при 0-4°С не менее, чем на 72 часа, надосадочную жидкость (супернатант) длительно диализовали до полного удаления ионов аммония (контролируя по реакции с реактивом Несслера) и далее исследовали на проявление мембранотропной активности адгезиометрическим методом [12]. Аналогично получали тканевой экстракт гепатопанкреаса краба, экстрагируя ее после оттаивания физиологическим раствором для тканей ракообразных (2,92 г NaCl; 0,075 г KCl; 0,44 г СаCl2 на 100 мл), кондиционную среду гриба Fusarium s. перед высаливанием центрифугировали. В образовавшихся фракциях супернатантов и осадков определяли мембранотропную активность с помощью адгезиометрического метода биотестирования МГТБ [12]. CCl4-индуцированный фиброз вызывали в печени крыс Wistar (150 г, самцы) 8-кратными внутрибрюшинными инъекциями гепатотоксина, проводимыми через 2 дня в течение месяца. Были исследованы следующие препараты: водный раствор супернатанта экстракта печени крыс в концентрации 10-14 мг белка в мл (группа 1); водный раствор супернатанта экстракта гепатопанкреаса краба в концентрации 10-10 мг белка в мл (группа 2); водный раствор супернатанта культуральной среды гриба Fusarium s. в концентрации 10-13 мг белка в мл (группа 3). Фармакологический препарат Силимар был взят в качестве положительного контроля, его добавляли в питьевую воду в концентрации, соответствующей терапевтической дозе в пересчете на массу тела крыс (группа 4). Контрольная группа животных принимала воду (группа 5). Животные принимали препараты с питьевой водой постоянно после первого введения гепатотоксина. В каждой группе находилось по 7 крыс, которых выводили из эксперимента на 60-й день – по 3 животных, на 120-й день – по 4 животных. Печень фиксировали в растворе формалина и приготавливали гистологические препараты, которые окрашивали по Маллори.
Оценку состояния ткани печени осуществляли на основании данных гистологического исследования. Степень поражения ткани печени фиброзом оценивали количественно, используя свободно распространяемую программу ImageJ путем подсчета площади, занимаемой на одном конкретном гистологическом срезе фиброзной ткани, имеющей характерную окраску по Маллори, и приведению ее к общей площади всего гистологического среза. Для каждой экспериментальной точки для каждого животного изучали не менее 4-х срезов. Полученные данные обрабатывали статистически с применением критерия Манна-Уитни.
Результаты и их обсуждение.
Полученные после высаливания сульфатом аммония тканевых экстрактов фракции супернатантов и осадков изучали методом биотестирования для обнаружения МГТБ [12]. Было показано, что все фракции супернатантов обладают характерной для данных биорегуляторов мембранотропной активностью, поэтому их далее исследовали на модели индуцированного фиброза печени крыс in vivo. На 60-й день эксперимента печень крыс всех групп характеризуется значительным развитием жировой дистрофии и наличием признаков фиброза. Обращает внимание значительное развитие фиброза у крыс в группах 1 (принимавших препарат, полученный из печени крыс) и 4 (фармакологический препарат Силимар) (Рисунок 1). На 120-й день эксперимента состояние печени в группе 1 практически не изменяется, но значительно отличается от состояния печени крыс контрольной группы, у которых происходит дальнейшее развитие фиброза. Полученные данные указывают на способность препарата, выделенного из печени крыс, тормозить развитие возникшего у животных фиброза печени, несмотря на отмеченное свойство стимулировать первоначальный этап развития патологии. Следует отметить, что сходные результаты получены для группы крыс, получавших лекарственный препарат Силимар (экстракт, полученный из плодов расторопши пятнистой Silibum marianum L). Поскольку ранее было установлено, что в основе фармакологического действия Силимара лежит его антиоксидантное свойство, а именно стабилизация ПОЛ в плазматических мембранах гепатоцитов [13], а также его способность стимулировать регенерацию печени за счет активации РНК-полимеразы, можно предположить, что препарат, выделенный из печени крыс, может также влиять на эти процессы. Данные, приведенные в Табл.1, показывают на эффективное действие препарата, выделенного из ткани гепатопанкреаса краба камчатского: он препятствовал дальнейшему прогрессу фиброза в печени крыс 2-й группы, а его прием в период с 60 по 120-й день эксперимента вызвал значительное уменьшение признаков развития жировой дистрофии в печени животных. В отличие от данного препарата, препарат, выделенный из гриба Fusarium s., также препятствовал возникновению фиброза на начальном этапе, но не предотвращал его дальнейшее развитие в период с 60 по 120-й дни (Рисунок 2).
В настоящее
время показано, что основу изучаемых нами препаратов составляют пептидно-белковые комплексы,
содержащие небольшие
пептиды, которые находятся во взаимодействии с более высокомолекулярными белками [10, 11]. Например, биорегулятор, выделенный из печени крыс, МГТБ представляет собой комплекс пептидов
с молекулярными массами до 6000 Да и сывороточного альбумина с молекулярной массой 68674 Да [8]. Для биорегуляторов из гепатопанкреаса краба и Fusarium s. также показано присутствие небольших
пептидов, взаимодействующих с еще не идентифицированными высокомолекулярными белками, которые модулируют
активность этих пептидов.
Изучение состава и структуры
МГТБ, полученных из данных объектов будет являться предметом
наших дальнейших исследований.
Таким образом,
в настоящем исследовании на модели CCl4-индуцированного фиброза печени у
крыс было показано, что препараты, содержащие биорегуляторы новой группы (мембранотропные гомеостатические тканеспецифические
биорегуляторы), выделенные из печени крыс, гепатопанкреаса краба и гриба Fusarium sambucinum в низких
дозах вызывали замедление развития патологического процесса, что выражалось в уменьшении площади фибротической ткани и уменьшении признаков
жировой дистрофии.
Список литературы
1. Богданов В.В., Березин Б.Б., Ильина А.П., Ямскова
В.П., Ямсков И.А. Биологически активные пептиды гепатопанкреаса
камчатского краба //Прикладная биохимия и микробиология. 2015. Т. 51. №4. С. 1–7.
2. Богданов В.В., Фаткулина Э.Ф., Березин Б.Б.,
Ильина А.П., Ямскова В.П.,
Ямсков И.А. Пептидсодержащая фракция из культуральной среды Fusarium Sambucinum: состав и биологическое действие // Прикладная биохимия и микробиология. 2014. Т. 50. № 2. С. 177–183.
3. Воронцова М.А., Лиознер
Л.Д., Маркелова И.В., Пухальская Е.Ч. Тритон и аксолотль.
Москва.
Изд.«Советская наука». 1952. 295 С.
4.
Карапетян А.Ф., Дживанян
К.А. О регенераторном потенциале печени
озерной лягушки
Rana Ridibunda после частичной гепатэктомии // Цитология. 2006. Т. 48. С. 346–354.
5. Константиновский
А.А., Краснов М.С., Ямскова В.П., Рыбакова Е.Ю., Ямскова И.А. Исследование ранозаживляющего действия
биорегуляторов, выделенных из тканей глаза и сыворотки
крови быка, на модели экспериментальной травмы
роговицы у кроликов
in vivo // БЭБМ. 2012. № 2. С.177-182.
6. Краснов М.С., Ямскова В.П., Куликова О.Г., Ильина А.П., Маргасюк Д.В., Рыбакова
Е.Ю., Ямсков. И.А. Изучение новой группы биорегуляторов, выделенных из подорожника большого
// Прикладная биохимия
и микробиология. 2011. Т. 47. №2. С. 146-153.
7. Куликова О.Г., Ямскова В.П., Ильина А.П., Маргасюк Д.В., Молявка А.А., Ямсков И.А. Идентификация в луке репчатом нового биорегулятора, действующего в сверхмалых дозах // Прикладная биохимия и микробиология, 2011. Т. 47. №4. С. 1-5.
8. Мальцев Д.И. Тканеспецифические мембранотропные биорегуляторы, выделенные из печени и легкого млекопитающих. Автореф. дис. канд. биол. наук М., 2013. 25 С.
9. Ямскова В.П., Борисенко А.В., Краснов М.С.,
Ильина А.П., Рыбакова
Е.Ю., Мальцев Д.И., Ямсков И.А. Влияние биорегуляторов, выделенных из печени,
сыворотки крови и желчи млекопитающих, на состояние ткани печени
тритона при органотипическом культивировании // Клеточные технологии в биологии
и медицине. 2010. № 3. С. 156–164.
10. Ямскова В.П., Краснов
М.С., Ямсков И.А. Наноразмерные биорегуляторы тканей глаза млекопитающих как основа для фармакологических препаратов нового поколения. Изд-во
МАКС Пресс. Москва.
2009. 84 С.
11. Ямскова В.П., Краснов
М.С., Ямсков И.А. Новые экспериментальные и теоретические аспекты в биорегуляции. Механизм
действия мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов. Saarbrucken: Lambert Academic Publishing. 2012. 136 Р.
12. Ямскова В.П., Резникова М.М. Низкомолекулярный полипептид сыворотки крови теплокровных: влияние на клеточную
адгезию и пролиферацию // Журнал
общей биологии. 1991. Т.52. №2. С.181-191.
13. Lozano-Sepulveda SA, Bryan-Marrugo OL, Cordova-Fletes C, Gutierrez-Ruiz MC, Rivas-Estilla AM. Oxidative stress modulation in hepatitis C virus infected cells
// World J Hepatol.
2015 Dec 18 V. 7 I. 29 P. 2880-2889.
14. Sichel
G., Scalia M., Corsaro
C. // Microsc. Res. Tech. 2002. V. 57. P. 477–490.
