Поиск продуцентов коллагеназ представляет несомненный интерес для различных областей жизнедеятельности человека. Указанные ферментымогут использоваться в медицинской практике, косметологии, пищевой промышленности [2]. Ранее нами были разработаны подходы, позволяющие осуществлять поиск продуцентов коллагенази разработать методы их выделения[3, 4]. Использование при скрининге модифицированных субстратов, обладающих повышенной устойчивостью к протеолизу, является дополнительным критерием при отборе потенциальных продуцентов [1, 5].Целью настоящей работы являлся поиск новых продуцентов коллагеназ с использованием модифицированного и немодифицированного коллагена.

Культуры Aspergillusmangini, Penicilliummartensii, Penicilliumroqueforti, Penicilliumsteckii, Penicilliumvitale выращивали на скошенной поверхности агаризованной среды Чапека следующего состава (%): NaNO3 – 0,2; KH2PO4   - 0,1; MgSO4 x 7H2О – 0,05; KCl – 0,05; FeSO4x 7H2O – 0,001; CaCO3 – 0,3; сахароза – 2; агар – 2, (рН 6,8) в течение 7-ми суток в термостате при 260С. Для проведения поверхностного культивирования использовали агаризованные среды, содержащие солевой фон среды Чапека с заменой сахарозы на 2% нативного и модифицированного коллагена, полученного так, как это было описано нами ранее [4]. Протеолитическую способность микроорганизма оценивали по диаметру колоний на соответствующих субстратах после посева микромицетана агаризованную среду. Активность биосинтеза ферментов оценивали по индексу лизиса (Iлиз): Iлиз = R2лиз /R2кол, где Rлиз – радиус зоны лизиса, Rкол – радиус колонии.

Таблица 1 Параметры роста культур при поверхностном культивировании на средах, содержащих различные субстраты

 

Культура	Субстрат	Время культивирования, сутки
		3		4		5		6		7		10
		Dк, мм	Dл, мм	Dк, мм	Dл, мм	Dк, мм	Dл, мм	Dк, мм	Dл, мм	Dк, мм	Dл, мм	Dк, мм	Dл, мм
A. mangini	кн	11,2	19	14,5	28,5	18	32,3	21,8	40	21,3	55	ин	ин
	км	9,5	0	13,2	0	16,5	20	21,8	25,8	24,5	32,2	30,5	47,3
P. martensii	кн	12,1	20	17,2	27	21,7	36,7	26	41,3	28,2	48,8	30,2	ин
	км	8,7	0	12,7	0	14,8	16,3	20,8	24,7	23,5	32,3	29,7	44,7
P. roqueforti	кн	11	16,7	15,5	27,2	19	34,2	23,8	39,5	25,8	45	30	ин
	км	8,7	0	12,8	14,7	16,7	19,7	20,7	24,3	21,7	29,5	25,2	44
P. steckii	кн	14,8	17,0	19,7	21,3	24,7	31,5	29,8	41	35	45,8	46	67
	км	9,8	0	13,7	0	18,5	0	25,2	27,5	29,2	32,8	38,8	49,3

P. vitale	кн	15,8	16,8	21,2	23,5	25	27,3	27,3	27,3	28,8	28,8	39,2	39,2
	км	2	0	6	0	12,3	0	20	0	23	0	36	0

 

Примечание. Здесь и в других таблицах использованы следующие обозначения: Dк – диаметр колоний; Dл – диаметр зон лизиса;  кн – нативная  коллаген; км – модифицированный коллаген; ин – исследования не проводились.

 

Результаты исследования роста микромицетов при культивировании на различных средах приведены в таблице 1. Культура A. mangini росла значительно медленнее на среде, содержащей модифицированный коллаген, особенно на начальных этапах роста. Значительно позднее начали образовываться и зоны лизиса. При этом диаметр зон лизиса при культивировании на модифицированном субстрате был меньше в 1,5 – 1.7 раза. Исследования на 10 сутки на среде с нативным коллагеном не проводились, так как колонии слились. Скорости роста культурыP. martensiiна средах, содержащих модифицированный и нативный коллаген, отличались примерно в такой же степени, как и в случае первой культуры.

Аналогичные закономерности наблюдались и при культивировании P. steckii (табл. 1). При этом зоны лизиса на модифицированном субстрате образовывались на сутки позднее, и их размер был меньше зон лизиса на нативном коллагене в 1,2 – 1,4 раза. Однако необходимо отметить, что размер колоний при росте на обеих средах у этой культуры был наибольшим среди других исследованных дейтеромицетов.

Очень небольшие различия размеров зон лизиса при росте на модифицированных и немодифицированных средах, отмечались и при культивировании P. roqueforti. В некоторых случаях диаметры зон лизиса на модифицированном коллагене были сравнимы с теми же показателями, что и при росте на нативномсубстрате (табл. 1). Кроме того, образование зон лизиса на модифицированной среде начиналось на более ранних сроках (4 сутки культивирования), чем у всех остальных культур.

Наибольшие различия при росте на указанных субстратах наблюдались у культуры P. vitale. Зоны лизиса на модифицированном коллагене отсутствовали на всех этапах культивирования. При этом был значительно замедлен и рост колоний, особенно на начальных этапах (табл. 1).

Индекс лизиса является интегральным показателем, который свидетельствует о способности культуры секретировать протеолитические ферменты, гидролизующие соответствующий субстрат. В процессе проведенного исследования выявлено (табл. 2), что у всех микромицетов индексы лизиса были существенно ниже при росте на модифицированном белке и регистрировались на более поздних этапах культивирования. При этом у P. vitaleотсутствовали видимые зоны лизиса на модифицированном коллагене, и индексы лизиса на нативном субстратебыли очень небольшими.

Таблица 2  

Индексы лизиса при росте на нативном и модифицированном коллагене

Субстрат	Куль- тура	Время культивирования, сутки
		3	4	5	6	7	10
кн	A.mangini	2,9	3,7	3,2	3,4	6,7	ин
км		0	0	1,5	1,4	1,7	2,4
кн	P.roqueforti	2,3	3,1	3,3	2,8	3,0	ин
км		0	1,3	1,4	1,4	1,8	3,0
кн	P.steckii	1,3	1,2	1,6	1,9	1,7	2,1
км		0	0	0	1,2	1,3	1,6
кн	P.martensii	2,7	2,5	2,9	2,5	3,0	ин
км		0	0	1,2	1,4	1,9	2,3
кн	P.vitale	1,1	1,2	1,20	0	0	0
км		0	0	0	0	0	0

 

Максимальный индекс лизиса на нативном коллагене отмечался у A. mangini на 7 сутки культивирования (6,7) и был выше максимального  индекса  лизиса у других культур в 2,0 – 5,6 раза.

Относительно высокий индекс лизиса отмечался также P. roquefortiи P. martensii.При росте на модифицированном белке максимальный индекс лизиса зарегистрирован для P. roquefortiна 10 сутки. У A. mangini и P. martensii указанный показатель был ниже на 20 и 24% соответственно.

Комплексное изучение диаметров колоний, зон лизиса и индексов лизиса при поверхностном культивировании 5 микромицетов на средах с нативным и модифицированным коллагеном показало, что наибольшим протеолитическим потенциалом обладают культурыP.roqueforti,A.mangini и P. martensii.Указанныекультурыперспективныдляиспользованиявкачествепродуцентовколлагеназ.

Список литературы

 

1 .Гордонова И.К., Никитина З.К. Оценка протеолитической активности мицелиальных грибов – потенциальных деструкторов белковых субстратов // Сборник научных трудов по итогам международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы естественных и математических наук в современных условиях развития страны», выпуск III, С-Петербург, 11 января 2016 г., с. 56-59.

2 .Демина Н.С., Лысенко С.В. Коллагенолитические ферменты, секретируемые микроорганизмами (Обзор) // Микробиол. – 1996; 65(3): 293-304.

3 .Сухосырова Е.А., Никитина З.К., Яковлева М.Б., Вещикова Е.В., Быков В.А. Характеристика коллагенолитических ферментов, секретируемых дейтеромицетомAspergillusflavus. // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 2003. Т. 35. №5. С. 526-530.

4 .Яковлева М.Б., Зон Х.Ч., Никитина З.К., Быков В.А. Рост и синтез внеклеточных ферментов некоторыми видами дейтеромицетов, культивируемых на различных белковых субстратах // Вопросы биол., медиц. и фармацевтич. химии. – 2009; 1: 6-10.

5.Gordonova I.K., Nikitina Z.K. Search of proteinases secreting deuteromyces.Materials of the X International research and practice conference "Science, Technology and Higher Education", Canada, April 28-29, 2016. P.111-118.