БАКТЕРИАЛЬНАЯ ПРОТЕИНАЗА КАК КОРМОВАЯ ДОБАВКА ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ УСВОЯЕМОСТИ КОРМА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПТИЦЫ

АБСТРАКТ

Объектом  исследования  являлась  субтилизиноподобная  внеклеточная  протеиназа  B.pumilus.

Масштабирован процесс выделения фермента из культуральной жидкости и изучены свойства рекомбинантной протеиназы. Сделано заключение о высоком биотехнологическом потенциале фермента и его биобезопасности.

ВВЕДЕНИЕ

Проблема повышения продуктивности птицеводства чрезвычайно актуальна для обеспечения населения качественным белковым продуктом питания. Целью работы являлось получение и оценка бациллярной сериновой протеиназы для повышения эффективности конверсии питательных веществ и энергии кормов в птицеводстве. Действие бактериального белка направлено на эффективное расщепление белковых комплексов  в составе зерновых компонентов комбикормов птицы с целью увеличения усвояемости питательных веществ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали штамм B. subtilis pCS9, несущий ген субтилизиноподобной протеиназы B. pumilus [Sharipova et al., 2008]. Культивирование проводили в биореакторе Biotron LiFlus SP30L, который заполняли 15 л среды следующего состава (г/л): пептон («Sigma») – 20, CaCl2*2H2O – 0.6, MgSO4*7H2O – 0.5, NaCl – 3, MnSO4 – 0.1, Na2HPO4 – 0.2, NH4Cl – 0.2. Среда стерилизовалась в биореакторе 30 мин при 121°С, рН среды доводился до рН 8.5 автоматически и поддерживался  добавлением 2 Н NaOH через перистальтическую систему биореактора. 16-часовую культуру B. subtilis pCS9 вносили в биореактор в соотношении 2% от объема среды (300 мл), OП600 инокулята составляла 3 опт.ед. В биореактор вносили антибиотик эритромицин в конечной концентрации 20 мкг/мл и пеногаситель Софэксил 1250 (Софэкс, Москва). Культивирование проводили в течении 24 ч при 37°С при постоянной аэрации со скоростью потока 10 л/мин (уровень О2 не ниже 20%) при постоянном перемешивании 150-900 об/мин. К 24-му ч роста культуры активность фермента достигала максимума в 4.4 ед/мл. Ферментацию останавливали на 24 ч роста культуры. Клетки удаляли центрифугированием при 5000g в течение 15 мин на центрифуге Beckman Avanti JXN-26.

Очистку субтилизиноподобной протеиназы проводили на колонке с карбоксиметил-целлюлозой («Sigma»). Супернатант КЖ разводили в 10 раз дистиллированной водой, доводили до рН 6.3 и смешивали с КМ-целлюлозой, уравновешенной 0.02 М Na-ацетатным буфером, рН 6.3. Смесь выдерживали в течение 90 мин при постоянном перемешивании для сорбции фермента. Затем КМ-целлюлозу осаждали, удаляли надосадочную жидкость и помешали в колонку. Колонку промывали тем же буфером, белок элюировали 0.2 М Na-ацетатным буфером, рН 6.3. Во фракциях определяли уровень активности протеиназы, фракции с высокой активностью объединяли.

Степень чистоты фермента и молекулярную массу контролировали электрофоретически. Электрофорез проводили в 12,5%-ном ПААГ в присутствии Ds-Na по методу Лэммли [Laemmli, 1970].

Специфическую активность определяли по расщеплению хромогенного субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNa по методу Люблинской и др. [Люблинская, 1987]. За единицу активности принимали количество фермента, гидролизующего в условиях эксперимента 1 мкмоль субстрата за 1 мин.

Влияние ингибиторов на активность субтилизиноподобных протеиназ  изучали с  помощью ингибитора трипсина в соотношении фермент: ингибитор 1:10, PMSF - 1:1000, о-фенантролин и ЭДТА - 1:100. Раствор белка инкубировали с ингибитором в течение 1 ч при 37° в Tris-HCl-буфере, рН 8.5, протеолитическую активность определяли в отношении хромогенного субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNa, как описано выше.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

После проведения ферментации в биореакторе получили 12.8 л супернатанта культуральной жидкости с активностью 4.4 ед/мл. С помощью ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе получили 15886 ед. активности фермента для применения в качестве кормовой добавки при кормлении птиц. Фермент подвергали электрофорезу в 12.5% ПААГ,  получили белок с молекулярной массой 28 кДа, что соответствует молекулярной массе сериновой протеиназы B.pumilus (Mikhailova et al., 2009).

Изучали свойства рекомбинантного фермента. Температурный оптимум протеиназы составил 37°С. Для практического использования важно, что ионы кальция в конечной концентрации 5 мМ приводили к увеличению температурного оптимума фермента до 50°С (рис. 1А). При этом активность фермента увеличивалась в среднем на 40% при 50°С и на 60% при 55°С. Протеиназа была термостабильной в интервале от 0 – 40°С (рис. 1Б). рН-оптимум протеиназы составил рН 9.5. Протеиназа сохраняла стабильность в интервале рН 7–10 (рис. 2). В интервале рН 3-11 падение активности не превышало 40%. Исследовали влияние ингибиторов на субтилизиноподобную протеиназу. Протеиназа в соотношении фермент/ингибитор 1:1000 полностью ингибируются специфическим ингибитором сериновых протеиназ – PMSF и не ингибируются специфическими ингибиторами металлопротеиназ - ЭДТА и о-фенантролином в соотношении фермент/ингибитор 1:100. Активность протеиназы не подавлялась природными ингибиторами, такими как ингибитор трипсина, что позволит ей функционировать в желудочно-кишечном тракте кур.

Таблица 1 - Влияние ингибиторов на активностьпротеиназы

Таким образом, в присутствии ионов кальция увеличивается термостабильность протеиназы и температурный оптимум фермента смещается до 50°С. Фермент стабилен в широком диапазоне рН, что предполагает его функционирование на всем протяжении ЖКТ кур. На основании полученных данных, можно сделать заключение о высоком биотехнологическом потенциале фермента в качестве кормовых добавок для птиц.

*Работа выполнена за счет средств субсидии, выделенной в рамках государственной поддержки Казанского (Приволжского) федерального университета в целях повышения его конкурентоспособности среди ведущих мировых научно-образовательных центров, а также при поддержке РНФ (проект № 16-16- 04062).

Список литературы

1.        Люблинская, Л.А. p-Нитроанилиды пироглутамилпептидов – хромогенные субстраты сериновых пртеинназ [Текст] / Л.А. Люблинская, И. Хайду, Г.Н. Баландина // Биоорган. Химия. – 1987. – Т.13(6). – С. 748-753.

2.        Mikhailova, E.O. Biochemical properties of Bacillus intermedius subtilisin-like proteinase secreted by a Bacillus subtilis recombinant strain in its stationary phase of growth [Text] / E.O. Mikhailova, A.M. Mardanova, N.P. Balaban, G.N. Rudenskaya, O.N. Ilyinskaya, M.R. Sharipova // Biochemistry (Mosc). – 2009. – V. 74(3). – P. 308-15.

3.        Sharipova, M. The expression of the serine proteinase gene of B. intermedius in B. subtilis [Text] / M. Sharipova, N. Balaban, A. Kayumov // Microbiological Research. – 2008. – V. 163(1). – P. 39-50.

4.        Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 [Text] / U.K. Laemmli // Nature. – 1970. – V.227. – P.680-685.