СТАНДАРТИЗАЦИЯ СВЕРХКРИТИЧЕСКОГО УГЛЕКИСЛОТНОГО ЭКСТРАКТА ИЗ СЕМЯН ЧЕРНУШКИ ПОСЕВНОЙ

Поиск и разработка лекарственных средств растительного происхождения представляет собой многоуровневую систему, включающую сопряженные фитохимические, технологические, фармакологические и клинические исследования, а также государственную регистрацию и серийное производство с последующим выходом фитопрепарата на фармацевтический рынок. Каждый из вышеприведенных этапов специфичен и является гарантией качества лекарственного средства [7]. Особое место в этой системе занимают фармацевтические исследования, основная цель которых заключается в установлении качественного и количественного состава действующих веществ, как в исходном растительном сырье, так и в конечном продукте, а также контроль критических параметров технологического производства и, кроме того, анализ биологических объектов в ходе фармакологических и клинических испытаний. Следует отметить, что на химико- фармацевтической основе базируется одна из важнейших процедур в условиях современного производства фитопрепаратов – стандартизация [9]. В основе стандартизации растительного сырья и его фитопрепарата по действующим веществам должно лежать применение современных высокочувствительных физических и физико- химических методов анализа, обеспечивающих достоверность проводимых исследований. К тому же, в соответствии с требованиями отечественных и международных нормативных документов необходимо соблюдение сквозной стандартизации в ряду лекарственное растительное сырьефитопрепарат [12]. Данный принцип лег в основу стандартизации сверхкритического углекислотного экстракта чернушки посевной (СУЭЧП), получаемый из семян этого растения, издавна используемых с лечебной целью при заболеваниях желудочного-кишечного тракта [8]. Производство СУЭЧП осуществлялось с использованием одного из современных методов – флюидной экстракции. В ходе изучения технологических и химических показателей
сверхкритической углекислотной экстракции были определены ее оптимальные параметры: температура 550С,
давление 350 атмосфер, продолжительность процесса 60 минут. Указанные выше условия экстракции позволяют обеспечить концентрацию ведущего компонента - тимохинона в составе готового продукта более 3%. Однако, в составе липофильной фракции СУЭЧП помимо тимохинона, присутствуют также жирные кислоты, участвующие в совместно с ним, в обеспечении антиоксидантного и гепатопротекторного эффектов. Поэтому представлялось целесообразным контролировать качество СУЭЧП и по наличию жирных кислот. Стандартизацию углекислотного экстракта чернушки по его действующим биологически активным веществам проводили с использованием современных методов разделения: капиллярного электрофореза и газожидкостной хроматографии.
Таким образом, для придания сверхкритическому углекислотному экстракту из семян чернушки посевной статуса «Лекарственное средство» представлялось необходимым проведение исследования по его стандартизации с целью разработки показателей и норм их качества для последующего их включения в проект нормативной документации.
Целью настоящей работы явилось проведение стандартизации сверхкритического углекислотного экстракта из семян чернушки посевной.
Материал и методы. Объектом исследования служил сверхкритический углекислотный экстракт из семян чернушки посевной, полученный методом флюидной экстракции. Оценку его качества осуществляли в соответствии с ОСТ 91500.05.001-00 «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения». Учитывая липофильную природу СУЭЧП, нормирование его качества дополнительно проводили по показателям, предусмотренным ОФС «Olea Pinquia» (ст. 472 ГФ X). Таким образом, состав действующих веществ СУЭЧП, физико-химические свойства, а также наличие некоторых сопутствующих соединений, позволили обобщить и предложить следующие основные показатели для нормирования его качества: «Описание», «Подлинность», «Плотность», «Показатель преломления», «рН», «Кислотное число», «Йодное число», «Число омыления», «Перекисное число», «Количественное определение» [6, 10, 11].
Установление подлинности СУЭЧП проводили по наличию активных компонентов - тимохинона и жирных кислот. Для идентификации тимохинона в СУЭЧП использовали метод тонкослойной хроматографии в системе растворителей о-ксилол – циклогексан (8:2). На хроматограмме на уровне пятна стандартного образца (СО) тимохинона должно обнаруживаться флюоресцирующее в УФ-свете красно-коричневым цветом пятно. Дополнительно подлинность тимохинона в СУЭЧП устанавливали по времени миграции основного пика на электрофореграмме испытуемого раствора на приборе «Капель-104РТ», приготовленного для количественного определения в сравнении с временем миграции раствора СО тимохинона на электрофореграмме калибровочного раствора. Определение компонентного состава жирных кислот проводили с помощью газожидкостной хроматографии по времени удерживания на газожидкостном хроматографе «Хроматэк - Кристалл 5000» [4].
Перекисное число определяли в соответствии с ГОСТ Р 51487-99. «Масла растительные и жиры животные.
Метод определения перекисного числа» [5].
Определение показателя преломления, плотности, рН, а также кислотного числа, числа омыления, йодного числа определяли в соответствии с фармакопейными методиками [1, 2, 3].
Определение количественного содержания тимохинона в СУЭЧП осуществляли следующим образом. Для приготовления испытуемого раствора около 0,25 г (точная навеска) сверхкритического углекислотного экстракта помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляли 30 мл 50% спирта этилового, перемешивали до растворения и доводили объем раствора тем же растворителем до метки.
Для построения калибровочного графика готовили серию растворов СО тимохинона с учетом его фактического количественного содержания в образце. Для этого 0,25 г (точная навеска) тимохинона растворяли в 50% спирте этиловом в мерной колбе вместимостью 50 мл (раствор А), тщательно перемешивали до полного растворения и доводили до метки указанным растворителем. Затем вносили 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 5,0 мл стандартного раствора А в мерные колбы вместимостью 50 мл соответственно, и доводили до общего объема 50% спиртом этиловым. Калибровочные растворы СО тимохинона использовали свежеприготовленными. Анализируемые пробы дозировали в прибор не менее трех раз и регистрировали электрофореграммы для каждого ввода.
Результаты и их обсуждение. Для нормирования качества сверхкритического углекислотного экстракта чернушки посевной было получено пять серийных образцов. Идентификацию жирных кислот в СУЭЧП проводили по их временам удерживания, ориентировочное время и последовательность выхода которых приведено в Табл.1.
                                                                                                                            Таблица 1

 Результаты установления подлинности жирных кислот в сверхкритическом углекислотном экстракте чернушки посевной

Согласно информации, отображенной в Табл.1, жирнокислотный состав фитоэкстракта чернушки включает насыщенные (миристиновая, пальмитиновая, стеариновая), мононенасыщенные (олеиновая) и полиненасыщенные (линолевая и линоленовая) кислоты.
Обобщенные результаты оценки качества пяти серий СУЭЧП по основным физическим, физико- химическим и химическим показателям, в том числе и по содержанию тимохинона, представлены в Табл.2.

                                                                                                                            Таблица 2

 Результаты определения физических, физико-химических и химических показателей качества в сверхкритическом углекислотном экстракте чернушки посевной

Как видно из данных, представленных в Табл.2, значения плотности и показателя преломления СУЭЧП находились в пределах от 0,923±0,001 до 0,926±0,002 г/мл и от 1,472±0,004 до 1,475±0,001, соответственно. При установлении рН среды СУЭЧП его значение варьировало в пределах 5,9±0,1 - 6,6±0,3. Полученные данные позволяют нормировать качество экстракта чернушки по показателям «Плотность» в интервале 0,922-0,928 г/мл,
«рН» - 5,8-7,0, «Показатель преломления» - 1,466-1,476.
Результаты изучения химических констант (Табл.2) серийных образцов СУЭЧП дают возможность ввести в его стандарт качества содержание кислотного числа – не более 24,0, числа омыления - 163-172 мг KOH/г и йодного числа - 70-80 г йода/100 г. Что касается определения перекисного числа, то установление его количественного содержания позволило нормировать данный показатель качества экстракта чернушки на уровне не более 26,0 моль активного кислорода/кг. Введение в нормативную документацию на СУЭЧП вышеперечисленных показателей качества позволит выявить недоброкачественную, фальсифицированную и контрафактную продукцию.
Данные по количественному определению тимохинона в СУЭЧП методом капиллярного электрофореза позволили определить его содержание на уровне не менее 3,5%.
Учитывая результаты исследований физических, химических и физико-химических показателей качества, а также действующих биологически активных веществ сверхкритического углекислотного экстракта из семян чернушки посевной предложены нормы его качества, которые приведены в обобщенной спецификационной Табл.3.

                                                                                                                             Таблица 3
Основные показатели качества сверхкритического углекислотного экстракта чернушки посевной

Таким образом, проведена стандартизация сверхкритического углекислотного экстракта из семян чернушки посевной, по результатам которой разработаны основные показатели и нормы его качества для включения их в проект нормативной документации на это потенциальное лекарственное средство.

Список литературы

1. Государственная фармакопея СССР: Вып. 1. Общие методы анализа / МЗ СССР.- 11-е изд. - М.: Медицина, 1987. -336с.
2. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ ССР.– 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1989. - 400с.
3. Государственная фармакопея Российской Федерации / «Издательство «Научный центр экспертизы средств медицинского применения», 2008. – 704с.
4. ГОСТ Р 51483-99. «Масла растительные и жиры животные. Определение методом газовой хроматографии массовой доли метиловых эфиров индивидуальных жирных кислот к их сумме». М.: Стандартинформ, - 2005. - 11с.
5. ГОСТ Р 51487-99. «Масла растительные и жиры животные. Метод определения перекисного числа». М.: Госстандарт России, - 2001. - 6с.
6. Мелентьева Т.А. Разработка фармакопейных статей по определению показателей качества жирных и эфирных масел / Т.А. Мелентьева, И.П. Рудакова, И.А. Самылина // Фармация. - 2007. - № 2. – С. 3-4.
7. Правила организации производства и контроля качества лекарственных средств из растительного сырья / Н.В. Пятигорская, И.А. Самылина, В.В. Береговых [и др.]. – СПб.: СпецЛит, 2013. - 367с.
8. Рудь Н.К. Основные результаты фитохимического и фармакологического исследования чернушки посевной (обзор) / Н.К. Рудь, А.М. Сампиев, Н.А. Давитавян // Научные ведомости БелГУ. Серия: Медицина. Фармация.-2013.-№25 (168), выпуск 24.-С.207-212.
9. Стандартизация и контроль качества лекарственных средств / Н.А. Тюкавкина, А.С. Берлянд, Т.Е. Елизарова [и др.]; Под ред. Н.А. Тюкавкиной. – М.: ООО «Медицинское информационное агенство», 2008.– 384с.
10. Требования к фармакопейной статье «Жирные масла» / Н.В. Сегуру, В.В. Вандышев, И.П. Рудакова, И.А. Самылина // Фармация. - 2007. - № 8. – С. 3-5.
11. Шиков А.Н. Растительные масла и масляные экстракты: технология, стандартизация, свойства / А.Н. Шиков, В.Г. Макаров, В.Е. Рыженков. – М.: Издательский дом «Русский врач», 2004. – 264с.
12. Шемерянкина Т.Б. Требования к стандартизации лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов на его основе / Т.Б. Шемерянкина, Т.А. Сокольская, Т.Д. Даргаева // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. – 2010. - №3. – С.9-12.