ОПРЕДЕЛЕНИЕ 2-МЕТОКСИФЕНОЛА В БИОЖИДКОСТЯХ МЕТОДОМ СПЕКТРОФОТОМЕРИИ

2-метоксифенол или гваякол относится к классу фенольных эфиров. Представляет собой маслянистую жидкость от прозрачного до светло-желтого цвета. Имеет специфический дымный запах со жгучим вкусом. Температура кипения 205оС при 760 мм рт. ст., температура плавления – 26-32оС, температура вспышки – 82оС. Растворимость – 1,6 г на 100 г воды при 15оС. Брутто-формула C7H8O2, молекулярная масса 124,139 г/моль [1].

2-метоксифенол и его производные входят  в состав лекарственных средств,  применяемых при инфекции дыхательных путей, а также препаратов и ароматизаторов, использующихся в промышленности для бездымного копчения [3, 6]. Является сырьевым источником для синтеза душистых веществ (ванилин, эвгенол и пр.).

При определенных концентрациях рассматриваемое вещество способно оказывать токсическое действие. Так у гидробионтов его полулетальная доза (LD50) равна 0,076 г/л, у крыс 0,620 г/кг (орально), у кроликов 4,6 г/кг (дермально), у человека 50 г/кг (орально) [1]. 2-метоксифенол, являясь фенолпроизводным, вызывает схожие с фенолом действия: головокружение, слабость, изменение температуры тела, появление профузного пота и бледности кожных покровов, увеличенное мочевыделение. При попадании внутрь вызывает жжение, боли в гортани, пищеводе и желудке. Пары 2-метоксифенола способны раздражать слизистую оболочку дыхательных путей и конъюнктиву глазного яблока. Проникновение в больших концентрациях через кожу может привести к неврозу. При хроническом отравлении в производственных условиях возможно заболевание дыхательной системы (бронхит), а также проявление астено-невротического синдрома [10].

Описаны случаи смерти от отравления 2-метоксифенолом и близкими по структуре алкил- и алкенилфенолами [1, 4, 5, 8, 9].

Существуют различные методы определения 2-метоксифенола в объектах окружающей среды, а также пищевой промышленности. Определение гваякола в воздушной среде осуществляется при помощи газовой хроматографии с  твердофазной микроэкстракцией [2], либо на основе реакции азосочетания с диазотированным п-нитроанилином и дальнейшим фотометрированием полученного раствора. Для анализа природной, питьевой и очищенной сточных вод на присутствие 2-метоксифенола используют хроматографическую колонку, заполненную полимерными адсорбентами, и детектируют оптическим методом [7]. Для соковой продукции существует метод газовой хроматографии, основанный на извлечении исследуемого вещества из пробы этилацетатом, его концентрировании с последующим разделением и идентификацией.

Однако вопрос определения 2-метоксифенола в биожидкостях человека остается недостаточно изученным.

Для решения этого вопроса может использоваться метод УФ-спектрофотометрии как относительно доступный, простой и малозатратный.

Цель  настоящего  исследования  –  разработка  методики  идентификации  и  количественного определения 2-метоксифенола в биожидкостях с использованием УФ-спектрофотометрии.

Материалы и методы исследования

Объект исследования - стандартный образец 2-МОГОБ (2-метоксифенола) фирмы «Fluka» с содержанием основного вещества ≥ 98%.

В качестве растворителей были выбраны ацетонитрил (х.ч.), этанол 95%, этилацетат (ГОСТ 8981- 78)    и 0,1 н. раствор гидроксида натрия (ТУ2642-001-56278322-2008). Для исследования спектров 2-МОГОБ готовили растворы в том или ином растворителе с концентрацией аналита 0,0005-0,005%. Измерения оптической плотности каждого из растворов проводили в области длинн волн 200-400 нм в кюветках с толщиной поглощающего слоя 10 мм при помощи спектрофотометра Сary 60 (Agilent,США).

В качестве биологических объектов рассматривали кровь и плазму крови человека. Для экспериментов готовили модельные смеси 2-МОГОБ с каждой из биожидкостей с содержанием аналита 0,005-0,1%.

Изолирование 2-МОГОБ из биожидкостей осуществляли смесью этилацетат-ацетон в соотношении 7:3 по объёму. Очистку извлечений проводили методом ТСХ на пластинах «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ, используя подвижную фазу хлороформ-бензол (9:1).

Результаты исследования и их обсуждение

Исследования особенностей поглощения УФ-излучения 2-МОГОБ в различных растворяющих средах показало наличие во всех спектрах выраженной длинноволновой полосы с максимумами в области 282 нм (среда ацетонитрила) 280 нм (среда этилацетата), 282 нм (среда этанола), 295 нм (среда 0,1 н. раствора гидроксида натрия). Из полученных данных видно, что в спектре, снятом в среде ионизирующего растворителя (0,1 н. раствор гидроксида натрия) максимум длинноволновой полосы располагается на 13-15 нм ближе к видимой области, чем в спектрах, снятых в средах трёх других растворителей.

Для идентификации и количественного определения 2-МОГОБ в качестве растворяющей среды рассмотрена возможность применения ацетонитрила. В процессе исследования готовили серию растворов с концентрацией аналита в ацетонитриле (мкг/мл): 2,5; 5,0; 7,5; 10,0; 20,0; 30,0.

В области длин волн 200-400 нм в кюветках с толщиной поглощающего слоя 10 мм поочередно проводили измерения оптической плотности растворов с различным содержанием 2-МОГОБ при помощи спектрофотометра Сary60 (Agilent,США).

По значениям оптической плотности градуировочных растворов 2-МОГОБ в ацетонитриле, измеряемой в области длинноволнового (282 нм) максимума, строили график зависимости оптической плотности (А, ед. о. п.) от концентрации анализируемого вещества в фотометрируемом растворе (С, мкг/мл), который описывается уравнением прямой линии и имеет вид: А=0,019532∙С+0,138186 (коэффициент корреляции r=0,9976) (см. рисунок).

Разработана методика спектрофотометрического определения 2-МОГОБ по поглощению в среде ацетонитрила. Относительная ошибка среднего результата составляет 0,92 % (n=6; P=0,95).

На основе предлагаемой методики была предложена схема определения 2-МОГОБ в крови и плазме, которая включала изолирование банкола из биологической матрицы, его очистку, идентификацию и количественное определение.

Изолирование. 25 г искусственной смеси аналита с биожидкостью или такую же массу контрольного образца биоматрицы настаивали дважды по 30 минут с порциями (50 г каждая) смеси этилацетат-ацетон (7:3) при перемешивании. Извлечение отделяли путём фильтрования через бумажный фильтр. Фильтр и остаток на фильтре промывали 20 г смеси этилацетат-ацетон (7:3). Фильтраты объединяли, фильтровали через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1 – 1,5 см, сульфат натрия промывали 20 г смеси этилацетат-ацетон (7:3). Фильтрат и промывную жидкость объединяли и испаряли в токе воздуха при комнатной температуре до 0,5-1,0 мл, а затем в токе азота до полного удаления растворителя.

Очистка и идентификация. Остаток растворяли в 10 мл ацетона. 0,5 мл полученного раствора наносили в виде полосы на линию старта хроматографической пластины «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ и хроматографировали используя подвижную фазу хлороформ-бензол (9:1). Исследуемое вещество идентифицировали по совпадению его значения Rf на хроматограмме с таковым вещества-свидетеля, которое составляло в данном случае 0,61±0,02.

После хроматографирования методом ТСХ участок хроматограммы с пятном анализируемого вещества вырезали из пластины, помещали в пробирку, элюировали вещество из сорбента ацетонитрилом в течение 15 минут и исследовали поглощение элюата в интервале длин волн 200-400 нм на фоне контрольного раствора. При необходимости анализируемый раствор разбавляли. Определяемое соединение идентифицировали по характерной форме спектральной кривой и положению максимумов поглощения.

Количественное определение. По величине оптической плотности ацетонитрильного элюата, измеренной при длине волны 282 нм, определяли количественное содержание вещества, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывали на определённую навеску биоматериала.

.Результаты количественного определения рассматриваемого соединения в крови и плазме методом УФ-спектрофотометрии представлены в таблице.

Результаты количественного определения 2-метоксигидроксибензола (2-МОГОБ) в крови и плазме на основе изолирования смесью этилацетат-ацетон (7:3) и очистки методом ТСХ (n=5, P=0,95)

Как свидетельствуют полученные данные, при содержании анализируемого вещества в количестве 2,5-50,0 мг в 25 г биожидкости с помощью разработанной методики удаётся определить в крови 88,65- 89,53% 2-МОГОБ с полушириной доверительного интервала 2,87-3,94%, в плазме – 91,39-92,12% данного соединения с полушириной доверительного интервала 2,60-3,77%. Определяемый минимум аналита в 100 г крови составляет 0,24 мг, в 100 г плазмы – 0,18 мг.

Выводы

1.   Изучены особенности свето-поглощения 2-метоксигидроксибензола в жидких средах. В качестве растворяющей среды для определения соединения спектрофотометрическом методом предложен ацетонитрил.

2.     В Уф-спектре 2-метоксигидроксибензола в среде ацетонитрила присутствуют характерная длинноволновая полосы с максимумом при 282 нм.

При количественном определении аналита в субстанции спектрофотометрическим методом по

поглощению в ацетонитриле относительная ошибка определения не превышает 1% (n=6; P=0,95).

3.         Показана возможность применения разработанной методики для определения 2- метоксигидроксибензола в биологических жидкостях.

Предложенная схема определения аналита в биожидкостях включает изолирование смесью этилацетат-ацетон (7:3), очистку методом ТСХ идентификацию и оценку количественного содержания методом спектрофотометрии.

4.     В соответствии с предложенной схемой в крови определяется (88,65-89,53)±(2,87-3,94) %, в плазме – (91,39-92,12)±(2,60-3,77) % 2-метокси-гидроксибензола.

Список литературы

1.   Асташкина А.П., Шорманов В.К., Останин М.А., Гришечко О.И., Елизарова М.К. Распределение метоксипроизводных гидроксибензола в организме теплокровных животных // Фармация. – 2013. – Т. 62, № 5. – С. 5-8.

2.      Волков С.М., Черновец А.Н. Определение концентрации фенолов в газовых выбросах промышленных предприятий методом газовой хроматографии с твердофазной микроэкстракцией // Сорбционные и хроматографические процессы. – 2010. – Т. 10. – №. 5. – С. 723-728.

3.      Ким Э.Н., Глебова Е.В. Исследование химического состава и технологических свойств современных коптильных препаратов // Известия ТИНРО. – 2008. – Т. 152. – С. 358-362.

4.    Оковитый С.В., Анисимова Н.А. Фармакологические подходы к противокашлевой терапии //

Российский медицинский журнал. – 2011. – Т. 19. – № 23. – С. 1450-1457.

5.   Пугачёва О.И., Асташкина А.П., Шорманов В.К., Останин М.А. Особенности распределения 2,4- и 2,6-диметильных производных гидроксибензола в организме теплокровных животных // Судебно- медицинская экспертиза. – 2014. – Т. 57, № 4. – С. 44-48.

6.   Родина Т.Г. Коптильные препараты и ароматизаторы // Вестник РЭА им. Г.В. Плеханова. – 2007.– № 2. – С. 110-111.

7.     Шачнева Е.Ю., Онькова Д.В., Серекова С.М. Способы определения фенолов в объектах окружающей среды // Астраханский вестник экологического образования. – 2013. – № 4. – 139 с.

8.    Шорманов В.К., Асташкина А.П., Останин М.А., Гришечко О.И., Цацуа Е.П. Особенности распределения 4-метоксигидроксибензола в организме теплокровных животных при летальных отравлениях // Судебно-медицинская экспертиза. – 2016. – Т. 59, № 4 . – С. 48-53.

9. Okic M., Johnson T., Crifasi J. A., Long C., Mitchell E. K. Swift Onset of Central Nervous System Depression and Asystole Following an Overdose of Guaifenesin // Journal of Analytical Toxicology. – 2013. – Vol. 37. – P. 318-319.

10. Orłowski J., Boruszak D. Toxicologic investigations of selected phenolic compounds. I. Acute and subacute toxicity of guaiacol, methyl-guaiacol and syringol // Folia medica Cracoviensia. – 1991. – Т. 32. –№ 3-4. – С. 309-317.