ВЛИЯНИЕ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ HAEMOPHILUS INFLUENZAE НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ МОНОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

Вступление. Липополисахариды (ЛПС) – это структурные компоненты грамотрицательных бактерий, эндотоксины, которые выполняют две важные функции: определяют антигенную специфичность и являются основними факторами патогенности. ЛПС грамотрицательных бактерий вызывают иммунологические реакции, в том числе поликлональную активацию иммунной системы, имеют способность стимулировать или угнетать ответ на конкретные антигены, индуцировать поликлональную иммунологическую толерантность. Рецепторы к ЛПС имеются в плазматических мембранах макрофагов, моноцитов, нейтрофилов и эндотелиоцитов. В фагоцитозе принимают участие в основном 2 группы клеток: гранулоциты и моноциты (макрофаги). Роль макрофагов состоит в распознавании, фагоцитозе, процессинге и продолжительной презентации детерминант возбудителей инфекционных заболеваний [5, 6]. Одновременно с антигенной презентацией осуществляется синтез интерлейкина-1 (ИЛ-1) – паракринный эффект, который создает гормональный фон иммунного взаимодействия с лимфоцитами-хелперами и последующим синтезом антител. Эндокринный эффект макрофагов – выделение цитокинов в кровоток – обеспечивает сигнальные функции, связанные с формированием генерализованной воспалительной реакции. ЛПС способствуют выделению моноцитами цитостатического фактора белковой природы (фактора некроза опухолей (ФНО), который обладает противоопухолевой активностью. ЛПС стимулируют гуморальный ответ и действуют иммуносупрессивно на клеточный иммунитет, влияют на функциональную активность макрофагов. На сегодняшний день выделяют ряд структурных компонентов бактериальной клетки, которые способны непосредственно вызывать образование провоспалительных цитокинов (ИЛ, ФНО). Прежде всего, это ЛПС, который запускает продукцию ИЛ-1, -6, -8, -10, ФНО-α, γ-интерферона, простагландинов, лейкотриенов, фактора активации. Доказано, что синтез цитокинов, как основных провоспалительных медиаторов, индуцируется грамотрицательными бактериями и обусловливает “большую” воспалительную природу бактериальных инфекций. У всех грамотрицательных бактерий определяется значительный разброс по способности индуцировать образование цитокинов (кроме ФНО): от одной сотой нг / мл у некоторых микроорганизмов до более чем 100 нг / мл у других [1, 2, 8].

Цель работы – изучить in vitro дозозависимое влияние ЛПС Haemophilus influenzaе (H. influenzaе) на функциональный статус моноцитов периферической крови человека.

Материалы и методы исследования. Объектом исследования были моноциты, выделенные из периферической крови 25 здоровых мужчин 18 – 34 лет. ЛПС были выделены из клеточных стенок бактерий, изолированных от 20 больных пневмонией (45 – 65 лет), вызванной H. influenzaе, которые находились на стационарном лечении в отделениях хирургического профиля в Луганской областной клинической больнице. ЛПС H. influenzaе использовали в концентрации 10, 50, 100 мкг / мл, контакт с моноцитами продолжался в течение 1 часа при температуре 37 ºС. Определяли фагоцитарную активность моноцитов чашечным методом, рассчитывая фагоцитарный индекс (ФИ), фагоцитарное число (ФЧ). Определяли продукцию клетками ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-α; оценивали изменение количества CD95+ моноцитов. В качестве контроля были приняты показатели интактных моноцитов. Полученные числовые результаты обрабатывали статистически [3, 4, 7].

Таблица 1

Показатели, принятые в качестве референтной нормы

Результаты исследования. Изменения секреторной активности моноцитов крови человека зависели от концентрации ЛПС. При использовании минимальной концентрации ЛПС H. influenzaе образование ИЛ-1β увеличивалось в 2,9 раза по сравнению с референтной нормой, ИЛ-6 – в 2,4 раза, ФНО-α – в 3,1 раза (р < 0,05). Повышение действующей дозы ЛПС H. influenzaе до 50 мкг / мл приводило к еще большей активации секреторной функции мононуклеаров. При данной концентрации продукция ИЛ-1β выросла против референтной нормы в 11,9 раза, ИЛ-6 и ФНО-α – в 9,8 и 6,8 раза соответственно.

При использовании ЛПС в дозе 100 мкг / мл стимуляция секреции монокинов была наибольшей, что проявилось увеличением концентрации ИЛ-1β в 37,2 раза, ИЛ-6 в 19,5 раза, ФНО-α в 22,4 раза.

Таблица 2    

Влияние ЛПС H. influenzaе на секреторную активность моноцитов in vitro

Примечание. * – р < 0,05; уровень значимости р рассчитан относительно среды 199 (референтная норма).

При использовании ЛПС H. influenzaе в малых концентрациях увеличивались показатели: ФИ и ФЧ. В концентрации 10 мкг / мл ЛПС H. influenzaе вызывали активацию фагоцитоза моноцитами. Кратность увеличения ФИ моноцитов была в 8 раз, ФЧ – в 1,23 раза против референтной нормы (р < 0,05). Наоборот, увеличение действующей концентрации ЛПС до 50 мкг / мл сопровождалось угнетением фагоцитарной активности моноцитов. При этом наблюдалось снижение ФИ и ФЧ моноцитов в 1,7 и 1,45 раза против референтной нормы (р < 0,05). Инкубация моноцитов с ЛПС H. influenzaе в концентрации 100 мкг / мл способствовала снижению ФИ в 3,4 раза, а ФЧ – в 3,9 раза по сравнению с референтной нормой.

Таблица 3

 Влияние ЛПС H. influenzaе на фагоцитарную активность моноцитов in vitro

Примечание. * – р < 0,05; уровень значимости р рассчитан относительно среды 199 (референтная норма).

Проведенные нами исследования также показали, что ЛПС грамотрицательных бактерий незначительно влияли на апоптоз моноцитов. Это влияние выражалось в статистически значимом увеличении количества моноцитов, которые несли на поверхности своей цитоплазматической мембраны специфический маркер апоптоза СD95+ только при стимуляции высокими действующими концентрациями ЛПС, преимущественно 100 мкг / мл. Малые дозы ЛПС (10 – 50 мкг / мл) апоптозиндуцирующего действия на моноциты крови человека практически не оказывали.

Инкубация моноцитов ЛПС H. influenzaе в концентрации 10 мкг / мл сопровождалась увеличением количества CD95+ моноцитов в 1,1 раза по сравнению с контролем. Обработка моноцитов ЛПС H. influenzaе в концентрации 50 мкг / мл вызывала увеличение CD95+ клеток в 1,2 раза в сравнении с референтной нормой. Концентрация ЛПС 100 мкг / мл способствовала увеличению концентрации CD95+клеток в 1,5 раза.

Таблица 4

 Влияние ЛПС H. influenzaе на апоптоз моноцитов in vitro

Примечание. * – р < 0,05; уровень значимости р рассчитан относительно среды 199 (референтная норма).

Выводы и перспективы дальнейших исследований в данном направлении. ЛПС грамотрицательных бактерий в условиях in vitro стимулируют секреторную функцию моноцитов и Т- хелперов первого типа крови человека. Под влиянием ЛПС повышается продукция моноцитами ИЛ-1β и ИЛ-6, ФНО-α и продукция ИЛ-2 Т-хелперами первого типа. Цитокинстимулирующая активность ЛПС является дозозависимой и видоспецифичной. Продукция указанных цитокинов прогрессивно растет по мере увеличения действующей на моноциты концентрации ЛПС. Таким образом, концентрации 10, 50 и 100 мкг / мл ЛПС H. influenzaе при взаимодействии с клетками в течение 1 часа при 37 ºС вызывает снижение фагоцитарной активности и активирует секрецию медиаторов моноцитами периферической крови человека. Наряду с этим, имеет место усиление экспонирования рецепторов к моноклональным антителам CD95+ на цитоплазматической мембране. Указанные нарушения были наиболее выражены при взаимодействии с концентрацией 100 мкг / мл ЛПС и наименее при взаимодействии с концентрацией 10 мкг / мл ЛПС. Данные, полученные нами в результате исследования, имеют ценность для дальнейшего углубленного изучения патогенеза гнойно-воспалительных заболеваний, которые вызываны возбудителем H. influenzaе.

Список литературы

1.       Борисова Е. В. Роль структурных частей бактериального липополисахарида в его индуктивной иммуносупрессивной активности [Текст] / Е. В. Борисова // Журнал микробиологии, эпидемиологии, иммунологии. – 1999. – № 6. – С. 65 – 68.

2.       Влияние липополисахаридов бактерий на секреторную активность моноцитов [Текст] / Н. К. Казимирко, В. М. Шанько, И. С. Гайдаш [и др.] // Тези доповідей наукової конференції «Четверті читання імені В. В. Підвисоцького», 26 – 27 мая 2005 г. – Одесса, 2005. – С. 46 – 47.

3.       Гайдаш І. С. Апоптозіндукуюча активність ліпополісахаридів збудників гнійно-запальних захворювань у хірургічних хворих [Текст] / І. С. Гайдаш, В. В. Флегонтова, Є. В. Суглобов // Вісник морської медицини. – 2000. – № 3. – С. 24 – 28.

4.       Добродеева Л. К. Содержание в периферической крови CD95+-лимфоцитов [Текст] /Л. К. Добродеева, К. Г. Добродеев, О. А. Миролюбова // Иммунология. – 1998. – № 6. – С. 13 – 14.

5.       Изучение способности моноцитов, выделенных из переферической крови, образовывать внеклеточные ловушки спонтанно или после активации [Текст] / И. И. Долгушин, О. Б. Прокопьева, Т. Г. Смирнова Т.Г. [и др.] // Иммунология. – 2012. – №5. – С. 240 – 243.

6.       Иммуносупрессивное действие патогенных грамотрицательных бактерий [Текст] / А. А. Воробьёв, Е. В. Борисова, О. С. Моложавая // Вестник Российской академии медицинских наук. – 2001. – № 2.– С. 21 – 25.

7.       Хаитов Современные подходы к оценке основних этапов фагоцитарного процесса [Текст] /Р. М. Хаитов, Б. В. Пинегин // Иммунология. – 1995. – № 4. – С.3 – 8.

8.       Ярилин Д. А. Роль фактора некроза опухолей в регуляции воспалительного ответа моноцитов и макрофагов [Текст] / Д. А. Ярилин // Иммунология. – 2014. – №4. – С. 195 – 201.