06 февраля 2016г.
Дыхательная недостаточность у новорожденных может быть обусловлена не только синдромом аспирации мекония, но и нарушением регуляции дыхания центрального происхождения (очаги поражения мозга и оболочек, родовая травма, гипоксически-ишемические изменения в центральной нервной системе, часто при родоразрешении путем кесарева сечения) [2]. Инфекционно-воспалительные осложнения, развивающиеся при применении искусственной вентиляции легких у новорожденных с дыхательными нарушениями, являются одной из основных причин смерти у этих детей.
Известно, что важная роль в иммунных процессах принадлежит цитокинам и они ответственны за развитие местных защитных реакций в тканях с участием различных типов клеток крови, эндотелия, эпителиев и соединительной ткани. На местном уровне цитокины регулируют все последовательные этапы развития воспаления и адекватность ответа на внедрение патогена. При этом необходимо, чтобы воспалительная реакция как защитная реакция организма, протекала в темпе и объеме, соответствующих степени повреждения. Активация клеток, усиление продукции провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, TNF-α) и хемокинов является необходимой в начальных фазах воспаления, однако, она становится проблемной, если степень активации перестает быть адекватной, когда первоначально защитный механизм перерастает в патологический [1].
Нарушение регуляции является условием патологических состояний и болезней. Так, чрезмерное воспаление, сопровождающееся избыточной продукцией и секрецией агрессивных радикалов и молекул, может превратиться в патологический процесс, приводящий к массивным повреждениям клеток и тканей организма. В этих случаях цитокины играют роль патогенетических факторов развивающихся заболеваний. В связи с этим система противовоспалительных (деактивирующих и ингибирующих) цитокинов также необходима и физиологически оправдана для жесткого контроля и в случае необходимости для негативной регуляции воспалительного процесса, не допускающей гиперпродукции провоспалительных цитокинов. Дефицит противовоспалительных цитокинов и/или их рецепторов приводит к развитию иммунодефицита, способствующего формированию очага хронического воспаления, аутоиммунных процессов, истощению функциональной активности фагоцитов.
В патологических условиях они могут или обеспечивать недостаточный контроль провоспалительной активности при иммуноопосредованных болезнях, или чрезмерно компенсировать и подавлять иммунный ответ и воспаление, подвергая организм риску системной инфекции [5].
Гиперпродукция цитокинов приводит к развитию системной воспалительной реакции, вовлечению отдаленных органов и систем, а дальнейшее нарастание их концентрации может служить причиной ряда патологических состояний, в частности, септического шока и полиорганной недостаточности [1]. Так по данным BoehringerN. с соавторами (1999) TNF-α играет ключевую роль в остром воспалении и может приводить к разным формам легочного повреждения [4]. Многие авторы полагают, что IL-8 является одним из наиболее важных цитокинов в патофизиологии острых легочных повреждений, усиливающим воспалительный каскад. Роль провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в патогенезе мекониально-аспирационного синдрома (МАС) и респираторного дистресс-синдрома (РДС) у доношенных новорожденных недостаточно исследована.
Отсутствие методики точного определения характера воспалительного процесса insitu в клинике новорожденных ограничивает патогенетическое обоснование назначения различных групп препаратов у новорожденных с МАС и РДС.
Существенным дополнением, в изучении дыхательных расстройств, стал бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ) и последующие иммуноферментные и цитологические исследования. В основу метода положено то, что клетки лаважной жидкости довольно точно отражают клеточный состав респираторной ткани легких, мелких бронхов и бронхов. В настоящее время разработана адекватная методика проведения БАЛ у новорожденных, однако работы посвященные исследованию БАЛ у доношенных новорожденных с РДС и МАС единичны и посвящены в основном недоношенным новорожденным с РДС.
Целью нашего исследования явилось сравнительное изучение параметров врожденного и адаптивного иммунитета у новорожденных с синдромом дыхательных расстройств (СДР) и у здоровых новорожденных.
Материалы и методы.
Иммунологическое обследование детей проводили в объединенной клинико-диагностической лаборатории Ростовского научно-исследовательского института акушерства и педиатрии с использованием стандартных тестов в соответствии с разработанной там же схемой иммунологического обследования, рекомендованной ВОЗ. Исследование было одобрено локальным этическим комитетом института. Всем пациентам, вошедшим в исследование, в процессе нахождения в отделении реанимации, осуществлялось динамическое клинико- лабораторное и иммунологическое обследование. Определение содержания цитокинов и альвеолярных макрофагов (АМ) в бронхоальвеолярном лаваже выполнено нами у 36 доношенных новорожденных: у 16 новорожденных с МАС и у 20 новорожденных с РДС. Исследование БАЛ проводилось сразу после поступления детей в отделение реанимации и в динамике (на 3-5-е сутки и на 20-е сутки заболевания).
Количественное определение содержания цитокинов в сыворотке крови и бронхоальвеолярном лаваже проводилось методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА = ELISA) с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента. Реакцию проводили согласно рекомендациям фирмы - производителя. Определяли IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, TGF-β1, RANTES с использованием тест-систем фирмы Biosource (США), BenderMedsistems (Австрия), R&DSystems (США).
Учет реакции проводили на многофункциональном программируемом счетчике для иммунологических исследований с компьютером и программным обеспечением MultilabelCounterVictor – 2 1420 (Финляндия).
Количественную оценку результатов проводили методом построения калибровочной кривой, на которой отражена зависимость оптической плотности (ОП) от концентрации исследуемого цитокина. Результаты выражали в пг/мл.
Чтобы избежать выброса цитокинов лейкоцитами крови exvivo, использовали специально разработанную методику забора материала. У новорожденных набирали 1 мл венозной крови в пробирку Vacutainer для получения плазмы с разделительным гелем и ЭДТА в качестве антикоагулянта (BectonDickinson, США), центрифугировали 3 минуты при 5 000 об/мин при 4°С и полученную плазму использовали для анализа. Оптическую плотность определяли при длине волны 450 нм.
Выделение АМ проводили в 36 пробах БАЛЖ, полученной у новорождѐнных, находящихся на ИВЛ. Для выделения АМ избран градиент фиколл-верографин ρ=1,048г/мл. Плотность раствора перед использованием контролировали на рефрактометре. В центрифужную (пластиковую) пробирку наливали градиент фиколл- верографина по 2 мл и наслаивали взвесь клеток БАЛ (плотность суспензии клеток 2 х 106кл/мл) в объѐме 2 мл. Сепарация клеток производилась при комнатной температуре центрифугированием при 1500 об/мин в течение 20 минут. Слой АМ в виде полосы белого цвета над сепарирующим раствором отсасывали пастеровской пипеткой и дважды отмывали раствором Хенкса в течение 10 мин при 1500 об/мин, затем ресуспендировали. Идентификацию клеток производили после окраски по Романовскому - Гимза на светооптическом микроскопе.
Экспрессию Толл-подобных рецепторов проводили на 3-х цветном проточном цитометре ―BeckmanCoulter‖ (США) с использованием реагентов фирмы ―BeckmanCoulter‖. Лизис осуществляли ручным методом раствором ―OptiLyseC‖ ―BeckmanCoulter‖. Для корректного исключения из зоны анализа всех частиц, которые не соответствовали по размерам и гранулярности, живым моноцитам, вводили необходимые логические ограничения в гистограммы распределения частиц по малоугловому, боковому светорассеянию.
При определении статистической обоснованности различия исследуемых групп применялся критерий Манна-Уитни для независимых групп и критерий Вилкоксона для связанных групп. В расчет принимались случаи при максимальном уровне ошибки первого рода <0,05.
Результаты и обсуждение.
Развитие воспалительного процесса в легких и реализация механизмов защиты легочной ткани от повреждения так же во многом определяются функциональной активностью альвеолярных макрофагов. Макрофаги легкого активно участвуют в формировании специфического иммунитета путем синтеза цитокинов и медиаторов, играющих роль регуляторов иммунного ответа. Альвеолярные макрофаги составляют 80-90% от всех клеток бронхоальвеолярной жидкости. Указанные вещества индуцируют пролиферацию, дифференциацию и эффекторную функцию лимфоцитов. Другая важная функция макрофагов заключается в презентации антигенов. Альвеолярным макрофагам свойственна наибольшая метаболическая и поглотительная активность. Известно, что альвеолярные макрофаги играют основную роль в легочной защите и элиминации бактерий из легких.
Нашими исследованиями установлено, что доля альвеолярных макрофагов в БАЛ оказалась достоверно ниже у новорожденных с МАС и РДС относительно здоровых новорожденных (61,81±1,23% и 62,05±0,86% против 81,83±2,51%, соответственно) (р<0,05).
При этом необходимо отметить, что на первые сутки наблюдения достоверных различий между новорожденными с МАС и РДС по содержанию альвеолярных макрофагов не выявлялось. Однако к 3-5 суткам наблюдения происходило заметное снижение содержания альвеолярных макрофагов у новорожденных с МАС и РДС, при этом у новорожденных с МАС верифицировался достоверно более низкий уровень содержания альвеолярных макрофагов (36,18±1,9% против 45,75±1,39%, соответственно) (р<0,05). Как показали результаты в динамике проведенных нами исследований, у новорожденных с МАС и РДС к 20-м суткам заболевания отмечался незначительный прирост содержания альвеолярных макрофагов, который носил не достоверный характер и не достигал нормативных значений (43,62±1,23% и 53,5±0,88% против 81,83±2,51%, соответственно) (р<0,05). К 20-м суткам заболевания у новорожденных с МАС содержание альвеолярных макрофагов было достоверно ниже относительно группы с РДС (43,62±1,23% против 53,5±0,88%, соответственно) (р<0,05).
Сравнительная характеристика цитокинов в БАЛ выявила, что у доношенных новорожденных с РДС содержание IL-1β в бронхоальвеолярном лаваже, аспирированном после поступления новорожденных в отделение реанимации, оказалось достоверно выше по сравнению с новорожденными с МАС (13,02±0,76 пг/мл против 6,54±0,74 пг/мл, соответственно) (р<0,05).
Небезынтересно, что к 3-5 суткам происходило увеличение продукции этого цитокина у новорожденных с РДС и МАС, однако при этом уровень IL-1β оставался достоверно выше у новорожденных с РДС (23±1,25 пг/мл против 18,87±1,56 пг/мл, соответственно) (р<0,05). При этом высокий уровень IL-1β у новорожденных с РДС на 3-5 -е сутки динамического наблюдения коррелировал с высокой концентрацией IL-6 в сыворотке крови (rs=0,47, p=0,04).
Следует отметить, что к 20-м суткам заболевания регистрировалось снижение продукции IL-1β в обеих группах, однако у доношенных новорожденных с РДС уровень IL-1β достоверно отличался от уровня новорожденных с МАС и составил 15,39±0,88 пг/мл против 6,42±0,59 пг/мл (р<0,05).
Продукция IL-6 – мультифакториального протеина, продуцируемого активированными альвеолярными макрофагами, у новорожденных с РДС была достоверно выше по сравнению с новорожденными с МАС (180,9±7,98 пг/мл против 132,28±9,2 пг/мл, соответственно) (р<0,05). Такое повышенное содержание IL-6 в БАЛ, возможно, свидетельствует о внутриутробном повреждении альвеолярного эпителия, что способствует развитию РДС и влияет на длительность ИВЛ.
На 3-5 сутки у новорожденных с РДС и МАС отмечалось увеличение содержания IL-6 до 276,16±10,22 пг/мл и 296,09±10,45 пг/мл, причем различия между группами носили достоверный характер (р<0,05). При этом высокий уровень IL-6 у новорожденных с РДС на 3-5-е сутки динамического наблюдения коррелировал с высокой концентрацией IL-8 в сыворотке крови (rs=0,44, p=0,04) и сниженной продукцией хемокина RANTES (rs=0,46, p=0,04). Необходимо отметить, что у новорожденных с МАС высокое содержание IL-6 в БАЛ имело корреляционную зависимость с высокой концентрацией IL-6 в сыворотке крови (rs=0,58, p=0,02) и корреляционную зависимость с низким уровнем RANTES в сыворотке крови (rs=0,5, p=0,02).
Резюмируя вышеизложенное, следует заключить, что изменения концентрации IL-6 в БАЛ в целом отражали процессы, происходящие в легких: повреждение альвеолярного эпителия, расстройства кровообращения.
Примечательно, что к 20-м суткам заболевания имело место снижение продукции IL-6, как маркера активности воспаления, в обеих группах и достоверных различий между ними не наблюдалось, хотя концентрация данного цитокина оставалась на высоком уровне у новорожденных с МАС и РДС. В этих группах также отмечена положительная клиническая динамика: дыхательная недостаточность разрешилась, и новорожденные были экстубированы.
Между тем, у новорожденных с МАС уровень продукции IL-6 недостоверно превысил уровень у новорожденных с РДС. Следует отметить, что высокий уровень IL-6 в БАЛ коррелировал с высоким содержанием IL-6 в плазме крови во все периоды динамического наблюдения (rs=0,57, p=0,04).
Исследования хемокина IL-8 у новорожденных с РДС и МАС выявили, что у новорожденных с РДС оказался статистически значимо повышен уровень IL-8 относительно группы с МАС (334,96±11,51 пг/мл против 271,7±16,42 пг/мл, соответственно) (р<0,05). Так, наиболее высокие показатели IL-8 отмечены на 3-5 сутки наблюдения 460,05±15,21 пг/мл у новорожденных с РДС и 379,25±19,45 пг/мл у новорожденных с МАС. К 20-м суткам заболевания регистрировалось напротив снижение содержания в БАЛ IL-8 в обеих группах, однако у новорожденных с РДС содержание IL-8 было все же достоверно выше относительно группы новорожденных с МАС (121,35±11,63 пг/мл против 68,56±7,99 пг/мл, соответственно) (р<0,05).
Аналогичные данные получены BauerT.T. с соавт. (2000) [3]. Авторами высказано предположение, что первичным источником IL-8 являются легкие, и этот критерий можно использовать при дифференциальной диагностике РДС.
Динамика содержания TNF-α в БАЛ у новорожденных с МАС и РДС была следующей: нами не отмечено достоверных отличий содержания TNF-α в БАЛ у новорожденных с МАС и РДС на момент поступления новорожденных в отделение реанимации (22,76±2,02 пг/мл и 22,21±1,75 пг/мл). При этом обнаружена корреляционная связь между TNF-α в БАЛ у новорожденных с РДС и TGF-β в сыворотке крови на первые сутки наблюдения (rs=0,47, p=0,03).
Однако на 3-5 сутки динамического наблюдения у новорожденных обеих групп экспрессия исследуемого интерлейкина увеличилась, хотя между группами не было достоверных отличий (37,62±2,27 пг/мл и 36,57±1,39 пг/мл). При этом высокий уровень TNF-α в БАЛ у новорожденных с МАС коррелировал с высоким содержанием IL-6 в сыворотке крови (rs=0,5, p=0,05).
К 20-м суткам заболевания продукция TNF-α в БАЛ у новорожденных с РДС оказалась достоверно выше, чем у новорожденных с МАС (21,06±1,92 пг/мл против 13,37±1,05 пг/мл, соответственно) (р<0,05). Такое избыточное образование TNF-α имеет, во-первых, прямой токсический эффект, а во-вторых, путем активации эндотелиально-лейкоцитарной адгезии молекул вызывает микроциркуляторное повреждение и васкулярную инфильтрацию с высвобождением цитотоксических факторов, активных форм кислорода и цитокинов.
Известно, что TGF-β принадлежит к суперсемейству протеинов, необходимых для клеточного роста и дифференцировки, а также для синтеза белков внеклеточного матрикса. Он является также мощным иммуномодулятором, проявляющим противовоспалительные свойства и ингибирующим развитие Th1-клеток [8].
Оказалось, что у новорожденных с МАС и РДС уровень TGF-β в БАЛ был существенно повышен, в то же время у новорожденных с РДС содержание TGF-β оказалось достоверно выше относительно группы с МАС (2031,15±161,89 пг/мл против 1457,31± 253,28 пг/мл, соответственно) (р<0,05). При этом высокий уровень TGF-β в БАЛ у новорожденных с РДС на первые сутки наблюдения коррелировал с высоким содержанием TNF-α в сыворотке крови (rs=0,46, p=0,04).
К 3-5 суткам динамического наблюдения наблюдалось увеличение продукции TGF-β в БАЛ в обеих группах новорожденных. При этом у новорожденных с РДС содержание TGF-β было достоверно выше относительно группы с МАС (2526,3±156,32 пг/мл против 2201,87±201,66 пг/мл, соответственно) (р<0,05). Следует отметить, что к 20-м суткам заболевания уровень TGF-β снижался в обеих группах, оставаясь у новорожденных с МАС достоверно выше относительно группы с РДС (р<0,05).
Общеизвестно, что RANTES и IL-8 ответственны за рекрутирование эффекторных клеток воспаления в легочную ткань. Нами было установлено, что у новорожденных с РДС имело место достоверное снижение содержания RANTES в БАЛ относительно группы с МАС во все сроки динамического наблюдения (р<0,05). Такое низкое содержание RANTES в БАЛ может свидетельствовать о нарушении физиологического процесса экспансии активированных клонов лимфоцитов в ткани легкого при РДС. Следует особо подчеркнуть, что у новорожденных с МАС выявлена корреляционная зависимость между содержанием в БАЛ RANTES на первые сутки наблюдения и TNF-α в сыворотке крови (rs=0,52, p=0,04), корреляционная зависимость между содержанием в БАЛ RANTES на 3-5 сутки наблюдения и TNF-α в сыворотке крови (rs=0,55, p=0,03), обратная корреляционная зависимость между содержанием в БАЛ RANTES на 3-5 сутки наблюдения и TGF-β в сыворотке крови (rs= -0,52, p=0,02).
Таким образом, резюмируя представленные результаты исследования, необходимо заключить, что при аспирации ферменты, соли желчных кислот и жиров в меконии новорожденных являются индуктором серьѐзного химического воспаления лѐгких, которое сопровождается повышением продукции IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, RANTES и снижением количества альвеолярных макрофагов. Полученные нами данные согласуются с работами OkazakiKetal., (2008), которые утверждают, что меконий почти всегда стерилен, но вызывает химическую пневмонию сходную с бактериальной [7].
Одновременно повышенный уровень противовоспалительного TGF-β1, возможно, является компенсаторным механизмом для уменьшения чрезмерного провоспалительного ответа при респираторном дистресс-синдроме и мекониальной аспирации.
Оценка продукции цитокинов в БАЛ у новорожденных с МАС и РДС выявила различные варианты цитокиновой регуляции. Пристального внимания заслуживает тот факт, что по полученным нами данным в БАЛ при РДС уже на 1-е сутки наблюдения регистрировалось достоверно повышенное содержание классических (ранних) провоспалительных цитокинов - IL-1β, TNF-α, что, очевидно, может свидетельствовать о внутриутробной формирующейся патологии легких и характеризовать тяжесть повреждения легкого. Нами также было установлено, что у новорожденных с РДС выявлялся достоверно более низкий уровень хемокина RANTES в БАЛ во все сроки наблюдения, что, очевидно, свидетельствует о низкой его активности при респираторном дистресс-синдроме.
Резюмируя вышеизложенное можно заключить, что у новорожденных с РДС к 20-м суткам заболевания сохраняется гиперпродукция IL-1β, IL-8, TNF-α и достоверно сниженное количество альвеолярных макрофагов относительно здоровых новорожденных. Так, KobayashiA. с соавт. (1998) регистрировали увеличение содержания IL-1β, IL-6, IL-8 в бронхоальвеолярной жидкости у больных с синдромом острого повреждения легких [6]. В процессе развития острого повреждения легких TNF-α увеличивает адгезию нейтрофилов к сосудистой стенке, усиливает их миграцию в ткани, способствует структурным и метаболическим изменениям эндотелиоцитов, нарушает проницаемость клеточных мембран, активирует образование других цитокинов, вызывает апоптоз и некроз эпителиальных клеток легких.
Выявленные нарушения свидетельствуют в большей степени о важной роли провоспалительных, противовоспалительных цитокинов и хемокинов в патогенезе дыхательных расстройств у новорожденных, обусловленных мекониальной аспирацией и респираторным дистресс-синдромом.
Используя полученные данные, можно контролировать течение воспалительного процесса в легких.
Нами была определена экспрессия TLR-2 (CD282+) и TLR-4 (CD284+) на моноцитах периферической крови у новорожденных с синдромом дыхательных расстройств (СДР) и у здоровых новорожденных. Установлено достоверное снижение экспрессии TLR-2 (54,98±0,78% против 78±0,67%) и TLR-4 (44,11±0,98% против 65,05±0,7%) у новорожденных с СДР по сравнению со здоровыми новорожденными (р<0,05). Следствием снижения уровня экспрессии на моноцитах рецепторов, распознающих патоген, может стать отсутствие адекватной реакции на проникновение чужеродных агентов, персистенция инфекции и хронизация процесса.
TLR могут служить новыми маркерами осложнений при респираторной патологии, а также потенциальной мишенью терапевтических вмешательств.
Таким образом, полученные данные выявили очевидные различия иммунного статуса у новорожденных с синдромом мекониальной аспирации и респираторным дистресс-синдромом. Эти данные могут стать основой для дальнейшего развития иммунокорригирующей терапии новорожденных с респираторными нарушениями с учетом обнаруженных различий иммунных нарушений.
Список литературы
1. Кнорринг Г.Ю. Цитокиновая сеть как мишень системной энзимотерапии // Цитокины и воспаление. – 2005. – Т. 4, № 4. – С. 45–49.
2. Сафонов И.В., Гребенников В.А. Респираторный дистресс-синдром новорожденных: профилактика и методы терапии // Российский журнал анестезиологии и интенсивной терапии. - 2000. - №1. – С. 69-80.
3. Bauer T.T., Monton C., Torres A. et al. Comparison of systemic cytokine levels in patients with acute respiratory distress syndrome, severe pneumonia, and controls // Thorax. – 2000. – Vol. 55, №1. – Р. 46–52.
4. Boehringer N., Hagens G., Songeon F. et al. Differential regulation tumor necrosing factor–alpha (TNF– alpha) and interleukin–10 (IL–10) secretion by protein kinase and phosphatase inhibitors in homam alveolar macrophages
// Europ. Cytokine Network. – 1999. – Vol. 10, N2. – P. 211–217.
5. Kasai T., Carlet J., Takakuwa T. et al. Anti–inflammatory cytokine levels in patients with septic shock // Res CommunMolPatholPharmacol. – 1997. – Vol. 98. – P.340–342.
6. Kobayashi A., Hashimoto S., Kooguchi K. et al. Expression of inducible nitric oxide synthase and inflammatory cytokines in alveolar macrophages of ARDS following sepsisi // Chest. – 1998 – Vol. 113, N 6. – P. 1632–1639.
7. Okazaki K., Kondo M., Kato M. et al. Temporal alterations in concentrations of sera cytokines/chemokines in sepsis due to group B streptococcus infection in a neonate // Jpn J Infect Dis. – 2008. – Vol. 61, N 5. – P. 382–385.
8. Thomson A. The Cytokine Handbook – New York: Acad. Press, 1998. – P. 1017.
