13 ноября 2015г.
Резюме
Приняв за основу значение витамина D как иммунорегуляторной молекулы, в целом, и модулятора цитокинового потенциала, в частности, нами проведена серия витральных экспериментов, характеризующих витамин D–опосредованную лимфоидную (лейкоцитарную) регуляцию синтеза цитокинов клетками эпителия бронхов у больных ХОЗЛ на фоне дефицита витамина D.
Ключевые слова: дефицит витамина D, хронические обструктивные заболевания легких.
VITAMIN D-MEDIATED LYMPHOID (LEUKOCYTE) REGULATION CYTOKINE BRONCHIAL EPITHELIUM CELLS IN PATIENTS WITH COPD VITAMIN D DEFICIENCY
Ivantsova N.L., Zayayeva G.A. , Klopotiy E.V., Belyakova A.G., Dmitrievskaya M.I.
State Institution «Crimean State Medical University named after S. I. Georgievsky», c.Simferopol
Summary
Taking as a basis the importance of vitamin D as immunoregulatory molecules in general, and potential modulator of cytokine, in particular, we have conducted a series of experiments characterizing the vitamin D-mediated lymphoid (leukocyte) regulation of cytokine synthesis by cells of the bronchi in patients with COPD against deficiency of vitamin D.
Keywords: deficiency of vitamin D, chronic obstructive pulmonary disease
Относить ХОЗЛ к заболеваниям, развитие которых ассоциировано с дефицитом витамина D, стали только в последние годы [1]. Так, исследования, проведенные Janssens W. и соавт. (2010), позволили установить, что дефицит витамина D у больных ХОЗЛ встречается достоверно чаще, чем у лиц без хронической бронхообструктивной патологии [2]. При этом выраженность дефицита витамина D коррелирует с уровнем снижения ОФВ1, а по мере нарастания тяжести бронхообструктивного заболевания отмечается достоверное углубление дефицита указанного витамина [3].
Применительно к проблеме дефицита витамина D также накоплено много научных фактов, свидетельствующих о возрастании уровня маркеров системного воспаления и формировании глубокого иммунного дисбаланса, а также об антивоспалительном влиянии заместительной терапии витамином D. Таким образом, можно предположить, что сочетанное течение ХОЗЛ и дефицита витамина D может явиться "фактором взаимного отягощения" развития субклинического генерализованного неспецифического воспаления и, как следствие, манифестации клинических проявлений системных эффектов указанных патологических состояний.
Материал и методы
В группы обследования вошли 58 больных ХОЗЛ I-III стадии в фазе ремиссии с дефицитом содержания 25(ОН)D3 в сыворотке крови≤ 20 нг/мл. Для коррекци и дефицита витамина Д применялся водный раствор витамина D3 в дозе 1000 МЕ (2 капли) в сутки (использовался АКВАДЕТРИМ® ВИТАМИН D3 (INN – colecalciferolum, холекалициферол) 15000 МЕ/мл.
Уровень интерлейкинов: IL-1β, TNF-a,TGF-β1 в сыворотке крови определя ли иммуноферментным методом с использованием коммерческих наборов (ООО "Цитокины" IL-1b, протеиновый контур – TNF-a, IL- 4), в соответствии с инструкцией производителя. Система разработана для определения биологически активного TGF-β1 в формате антительного сендвича. Оценка результатов осуществлялась фотометрически на иммуноферментном анализаторе «Униплан» (Россия). Оптическую плотность конечного продукта ферментативной реакции определяли фотометрически при длине волны 450 нм. Для культивирования бронхиального эпителия был использован метод краткосрочных органных культур, обеспечивающий культивирование эпителия in vitro по Лурия Е.А. [4], клетки эпителия бронхов получали из мокроты.
Параллельно проводились несколько экспериментов: опыт 1: культивация бронхиального эпителия в термостате при 37оС в течение трех суток ® исследование уровня цитокинов в супернатанте культуры клеток; опыт 2: суспензия аутологичных мононуклеарных клеток, в дозе 80´106 (контроль – в камере Горяева) ® в культуральную среду при начале культивирования ® культивация ® исследование уровня цитокинов; опыт 3: суспензия мононуклеаров перед введением в культуральную среду инкубировалась с витамином D (использовался химический аналог 1,25 (OH)2D3 – 24,25(OH)2D3 (Sigma-Aldrich, США), растворенный в этаноле ® отмывание клеток ® в культуральную среду при начале культивирования ® культивация ® исследование уровня цитокинов.
Результаты и обсуждение
Нами установлено что у больных под влиянием введения в культуральную среду взвеси мононуклеарных лейкоцитов (опыт 2) исследованный уровень IL-1β в супернатанте культуры клеток бронхиального эпителия существенно не меняется, а под влиянием преинкубации мононуклеаров с витамином D – статистически значимо снижается на 26,0 % (р1 и р2 < 0,001). Под влиянием введения в культуру клеток аутологичных мононуклеаров синтез TNF-α клетками эпителия бронхов возрастает на 45,1 % (р 1 < 0,001). Под влиянием витамин D–стимула выявлена отмена потенцирующего синтез провоспалительного цитокина TNF-α влияния мононуклеарных лейкоцитов.
Результаты исследования влияния витамина D на лимфоидную (лейкоцитарную) регуляцию синтеза IL- 1β TNF-α, TGF-β1 клетками эпителия бронхов у больных ХОЗЛ I -III стадии в фазе ремиссии с дефицитом витамина D представлены в Табл 1.
Таблица 1 Влияние витамина D на лимфоидную (лейкоцитарную) регуляцию синтеза IL-1β ,TNF-α и TGF -β1 клетками эпителия бронхов у больных ХОЗЛ с дефицитом витамина D пг/мл
|
Этапы витрального эксперимента
|
Уровень IL-1β в супернатанте культуральной среды культуры клеток бронхиального эпителия
|
Уровень
TNF-α в супернатанте культуральной среды
культуры клеток бронхиального эпителия
|
Уровень TGF-β1 в супернатанте культуральной среды
культуры клеток бронхиального эпителия
|
|
Опыт 1(IL-1β в культуральной среде), n=58
|
19,2 ± 0,7
|
16,2 ± 0,6
|
50,5 ± 1,4
|
|
Опыт 2 (в куль- туральную среду
вводится взвесь аутоло-гичных моно- нуклеаров) n=58
|
18,1 ± 0,6
р< 0,5
|
23,5 ± 0,7
р< 0,001
|
54,8 ± 1,3
р< 0,05
|
|
Опыт 3 (преинкубация
мононуклеаров с
24,25(OH)2D3 →
|
14,2 ± 0,4
p < 0,001
p1 < 0,001
|
17,0 ± 0,5
p < 0,5
p1 < 0,001
|
48,4 ± 1,7
p < 0,5
p1 < 0,01
|
|
отмывание клеток → в культуральную среду), n=58
|
|
|
|
Примечание: р – достоверность различий, высчитанная в сравнении с опытом 1, р1 – достоверность различий, высчитанная в сравнении с опытом 2.
Нами установлено, что у больных под влиянием введения в культуру клеток аутологичных мононуклеаров синтез активной формы TGF-β1 клетками эпителия бронхов возрастает на 8,5 % (р1 < 0,05). Под влиянием преинкубации мононуклеаров с 24,25(OH)2D3 выявлена отмена потенцирующего синтез TGF-β1 влияния мононуклеарных лейкоцитов: исследованный показатель возвращается к исходному (в опыте 1) уровню.
Выводы
1. У больных ХОЗЛ с дефицитом витамина Д выявлена способность аутологичных мононуклеарных лейкоцитов оказывать витамин D-индуцированное ингибирующее влияние на функциональную (синтез прово- спалительного цитокина IL-1β) активность клеток бронхиального эпителия и выявлена витамин D-опосредованная отмена потенцирующего синтез провоспалительного цитокина TNF-α и активной формы TGF-β1 влияния мононуклеарных лейкоцитов.
2. Комбинированное использование заместительной терапии витамином D у больных ХОЗЛ I-III стадии в фазе ремиссии с дефицитом витамина Д приводит к локальной и общей коррекции дисбаланса цитокинового гомеостаза, уменьшению риска фиброобразования за счет снижения TGF-β1 в эпителии бронхов, что в целом выражается улучшением клинико-функционального состояния больных.
Список литературы
1. Cantona M.T. Vitamin D and its role in immunology: multiple sclerosis and inflammatory bowel disease / M.T. Cantona // Progress Biophys. Molec. Biol. ¾ 2007. ¾Vol. 92. ¾ P. 60 – 64.
2. Prevalence and determinants of vitamin D deficiency in COPD outpatients / L. Verboom, Е.Е.М. van den Borne,
М.А. Spruit [et al.] // Eur. Respir. J. ¾ Suppl ¾2008. ¾P3374.
3. Vitamin D deficiency is highly prevalent in COPD and correlates with variants in the vitamin D-binding gene /
W. Janssens, R. Bouillon, B. Claes [et al.] //Thorax. ¾2010. ¾Vol. 65. ¾ Р. 215–220.
4. Лурия Е.А. Органные культуры кроветворной и лимфоидной ткани// Автореф. дис. ...д-ра биол. наук:
03.099. Академия мед. наук СССР. – М., 1972. – C.37.
