23 февраля 2016г.
Цель исследования: совершенствование методов лечения открытых переломов в эксперименте с использованием препарата «Винфар» на основе нового фактора роста фибробластов.
Материал и методы: В работе использовано 96 крыс линии «Wistar». Выполнено моделирование открытых переломов средней трети большеберцовой кости путѐм остеотомии через оперативный доступ 1,0 см. Интактная малоберцовая кость служила естественной шиной. Раны ушивались. 48 животным опытной группы дважды вводили в область перелома 0,2 мл препарата «Винфар» - интраоперационно непосредственно после остеотомии и через 24 часа. 48 крыс группы контроля получали 0,9% раствор NaCl. Выполнялись клинические наблюдения за животными. На 7, 14, 21, 28, 44 и 61 сутки по 8 крыс каждой группы были подвергнуты эвтаназии. Выполнены гистологические исследования тканей области перелома.
Результаты и выводы: При сравнительном анализе процесса регенерации кости выявлено, что у животных опытной группы процессы образования костной мозоли протекали в среднем на 7 дней быстрее, чем в группе контроля. Применение препарата «Винфар» на основе фактора роста фибробластов стимулирует репаративный остеогенез в эксперименте.
Ключевые слова: рана, открытый перелом, остеогенез, фактор роста фибробластов.
Введение. Травматизм является одной из ведущих причин общей заболеваемости взрослого населения [2]. Частота несращений костей при лечении переломов остается достаточно высокой и по данным разных авторов может достигать 30% [1].
Особенно тяжѐлые последствия возникают при открытых переломах. Причиной неудовлетворительных исходов при лечении открытых переломов является нарушение механизмов репаративного гистогенеза. К настоящему времени определен ряд способов воздействия и выявлены факторы влияния на разные звенья репаративной регенерации. Эти перспективные методы либо находятся в стадии изучения, либо их применение ограничено из-за технической сложности.
Одну из ключевых ролей в регенерации тканей играет группа пептидов, относящихся к фактору роста фибробластов (ФРФ). В настоящее время проводятся экспериментальные исследования для определения возможностей применения ФРФ в медицине [4, 6]. Фактор роста фибробластов человека выпускается в США и странах Западной Европы только для лабораторного применения. В Оренбургской государственной медицинской академии обнаружен природный штамм рода Bacillus, продуцирующий новый фактор роста фибробластов [3]. Этот фактор роста, в отличие от известных рекомбинантных ФРФ, термостабилен. Технология его получения проста, легко воспроизводима, не требует больших материальных вложений. На основе нового ФРФ создан препарат «Винфар».
Цель работы – совершенствование методов лечения открытых переломов в эксперименте с использованием препарата «Винфар» на основе нового фактора роста фибробластов.
Материал и методы.
Характеристика препарата. Обнаруженный фактор роста фибробластов – это комплекс термостабильных (до 128 0С) четырех усиливающих действие друг друга белков молекулярной массой от 11 до 14 kD. В разведении 1:10 – 1:20 он оказывает почти такое же стимулирующее действие на рост культуры клеток эмбриональных фибробластов человека и опухолевых клеток С6 глиомы, как и 5% фетальная сыворотка (стандарт). Фактор роста чувствителен к протеолизу под действием трипсина, имеет изоэлектрическую точку в области 9,2 – 9,3. Препарат «Винфар» произведѐн ООО «Бакорен», г.Оренбург, Россия.
Экспериментальные животные. Все эксперименты на животных выполнены в соответствии с требованиями «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1985) [9].
Манипуляции над животными. Для наркоза 1% раствор тиопентала натрия вводился 96 крысам внутрибрюшинно в дозе 40 мг на 1 кг массы животного. Из разреза 1,0 см по передней поверхности голени выполнена остеотомия большеберцовой кости в средней трети. Интактная малоберцовая кость служила естественной шиной. 48 крысам опытной группы в рану введено 0,2 мл препарата «Винфар», 48 животным группы контроля в рану введено 0,2 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Раны ушиты наглухо. Через 24 часа после операции крысам обеих групп в гематому области перелома инъекционно введено по 0,2 мл препарата «Винфар» и 0,9% раствора NaCl соответственно.
Ежедневно у животных этих двух групп оценивалось клиническое состояние ран, регистрировались потребление корма и воды, особенности поведения, масса тела животных. На 7, 14, 21, 28, 44 и 61 сутки по 8 крыс каждой группы были подвергнуты эвтаназии с помощью летальной дозы 1 % раствора тиопентала натрия (100 мг на 1 кг массы животного). Забирались ткани области перелома для гистологических исследований.
Статистическая обработка производилась на персональном компьютере с помощью лицензированного пакета прикладных программ «MS Office». При обработке полученных результатов использовались методы описательной статистики, критерий ANOVA.
Результаты.
Клинические наблюдения.
В результате наблюдения за поведением животных контрольной группы установлено, что нагружать оперированную конечность крысы начали через 10-14 дней после операции. Двигательная активность животных контрольной группы восстанавливалась до нормальной через 14-18 дней. Следует отметить, что уже с первых суток после операции крысы сами подходили к воде и корму.
Животные опытной группы с первых суток после операции хорошо ели обычный корм, через 7 дней после операции начинали активно нагружать оперированную конечность. Их двигательная активность возросла до нормальной через 10-12 дней, то есть в среднем на 5 суток раньше, чем в контрольной группе. Инфекционных осложнений области хирургического вмешательства не было.
Гистологические исследования.
7-е сутки. Контрольная группа: В зоне перелома на фоне развитой грануляционной ткани заметна пролиферация клеток мезенхимы, в небольшом количестве появляется волокнистый матрикс и небольшие группы остеогенных клеток. Остеокласты единичны, резорбция костных отломков не выражена. В эндостальной зоне перелома признаки пролиферации клеток эндоста с дифференцировкой в хондробласты и формированием хряща.
Опытная группа: начинает формироваться интермедиарная костная мозоль, состоящая из хряща, клеточный состав которого представлен хондробластами и небольшим числом хондроцитов. Центральные отделы интермедиарной зоны содержат редуцирующуюся грануляционную ткань с обилием волокнистого матрикса и пролиферирующих остеогенных клеток. Периостальная костная мозоль деградирует за счѐт лизиса хондроцитов и формирования хондрокластами очагов резорбции с замещением хряща на хорошо васкуляризованную волокнистую соединительную ткань. Со стороны эндоста, контактирующего с интермедиарной зоной, сформирована тонкая прослойка эндостальной костной мозоли, заполняющей костномозговой канал и переходящей в интермедиарную мозоль.
14-е сутки. Контрольная группа: В интермедиарной зоне перелома на фоне остатков редуцирующейся грануляционной ткани появляется волокнистый матрикс с группами пролиферирующих остеогенных клеток. Эндостальная костная мозоль глубоко заполняет весь просвет костномозгового канала и переходит в интермедиарную мозоль.
Опытная группа: интермедиарная костная мозоль представлена остатками деградирующего хряща и очагами формирования пластинчатой кости, состоящими преимущественно из остеобластов и незрелого внеклеточного остеоидного матрикса. Эндостальная костная мозоль представлена сформированными костными балками, состоящими из остеоцитов и зрелого внеклеточного остеоидного матрикса.
21 сутки. Контрольная группа: интермедиарная костная мозоль по-прежнему представлена очагами редуцирующейся грануляционной ткани и широкими участками волокнистого матрикса с группами пролиферирующих остеогенных клеток. Широкую эндостальную костную мозоль формируют костные балки, состоящие из остеобластов и остеоцитов, замурованных в остеоидный матрикс (Рисунок 1).
Рис.1. Контрольная группа. Область перелома большеберцовой кости (интермедиарная костная мозоль), 21 сутки. Окраска гематоксилин-эозин. Об.ув. х300.
Опытная группа: вся площадь интермедиарной костной мозоли представлена остатками деградирующего хряща и очагами формирования пластинчатой кости, состоящими преимущественно из остеобластов и незрелого внеклеточного остеоидного матрикса. Периостальная костная мозоль представлена широкими полями формирующейся пластинчатой кости. Эндостальная костная мозоль представлена узкой полоской сформированной костными балками пластинчатой кости на границе с интермедиарной зоной. При этом новообразованные балки эндостальной мозоли активно разрушаются многочисленными остеокластами, за счѐт формирования лакун резорбции (Рисунок 2).
Рис.2. Опытная группа. Область перелома большеберцовой кости (интермедиарная костная мозоль), 21 сутки. Окраска гематоксилин-эозин. Об.ув. х150
28 сутки. Контрольная группа: интермедиарная костная мозоль представлена широкими полями деградирующего хряща в центральном отделе и узкими очагами формирования пластинчатой кости на периферии, состоящими преимущественно из остеобластов и незрелого внеклеточного остеоидного матрикса. Периостальная костная мозоль представлена полями формирующейся пластинчатой кости и зрелого хряща с признаками деградации. Очаги ещѐ сохранѐнного хряща локализованы преимущественно в поверхностных отделах и центре периостальной мозоли.
Опытная группа: вся площадь интермедиарной костной мозоли представлена формирующимися балками пластинчатой кости, состоящими из остеобластов и остеоцитов, замурованных в остеоидный матрикс. Эндостальная костная мозоль представлена подвергающимися резорбции немногочисленными костными балками пластинчатой кости лишь на границе с интермедиарной зоной и расположенными, преимущественно у эндоста.
44 сутки. Контрольная группа: интермедиарная костная мозоль состоит из небольших очагов деградирующего хряща и формирующихся балок пластинчатой кости, состоящих из остеобластов и остеоцитов, замурованных в остеоидный матрикс. Эндостальная костная мозоль представлена подвергающимися резорбции многочисленными костными широкими балками пластинчатой кости.
Опытная группа: намечается ремоделирование интермедиарной костной мозоли в диафиз трубчатой кости: из, хаотично расположенных на более ранних сроках, балок пластинчатой кости начинают формироваться компактное и губчатое вещество. Костномозговой канал не образован, в составе компактного вещества - небольшое количество костномозговых полостей.
61 сутки. Контрольная группа: наблюдается перестройка интермедиарной костной мозоли в диафиз трубчатой кости.
Опытная группа: полная консолидация перелома с полноценной перестройкой костной мозоли в диафиз трубчатой кости с органотипичным строением периоста, компактного вещества и эндоста.
Выводы.
Нами установлено, что двукратное применение препарата «Винфар» при лечении открытых переломов приводит к снижению сроков образования костной мозоли и регенерации кости в среднем на 7 дней. Использование препарата привело к восстановлению органотипичного строения кости. Инфекционных осложнений при использовании «Винфар» не наблюдалось.
Технология производства препарата «Винфар» проста, легко воспроизводима, не требует больших материальных вложений. В настоящее время выполнены доклинические исследования безопасности препарата. Мы планируем представить «Винфар» для проведения государственных клинических испытаний
Список литературы
1. Ахмедов, Б.А. Оптимизация методов лечения раненых с огнестрельными переломами костей конечностей: автореф. дис. ... канд. мед. наук: 14.01.15, 14.01.17 / Багавдин Абдулгаджиевич Ахмедов - Санкт-Петербург, 2010. - 45с.
2. Баранов, О.П. Распространенность травматизма среди населения агропромышленного региона / О.П.Баранов // Проблемы социальной гигиены, здравоохранения и истории медицины. - 2012. - № 6. - С.13- 16.
3. Патент № 2427644 С1 RU МПК С12N А61К. Штамм бактерий Bacillus subtilis – продуцент фактора роста фибробластов. Никитенко В.И. – опубл. 27.08.11.
4. Akita, S. Basic fibroblast growth factor accelerates and improves second-degree burn wound healing / S.Akita, K. Akino, T.Imaizumi // Wound Repair Regen. – 2008. – Vol.16. – P. 635-641.
5. European Convention for the Protection of vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes. Council of Europe, Strasbourg, 1986.
6. Yao, C. Acceleration of wound healing in traumatic ulcers by absorbable collagen sponge containing recombinant basic fibroblast growth factor / C.Yao, P.Yao, H.Wu et al. // Biomed Mater. – 2006. - №1. - P.33-37.
