ПРИМЕНЕНИЕ РАМАНОВСКОЙ СПЕКТРОСКОПИИ В МЕДИЦИНЕ

В 1928 году в опытах по изучению рассеяния света в жидкостях индийские физики Ч. Раман и К. Кришнан открыли явление неупругого рассеяния, используя в качестве источника возбуждающего излучения солнечный луч. Применяя определенные комбинации абсорбционных светофильтров, они пришли к выводу, что в жидкостях происходит рассеяние света, сопровождаемое сдвигом частоты  w' = w0 - W (w0 - частота возбуждающего излучения, w' - частота рассеянного света), а результаты своих экспериментов интерпретировали как проявление оптического аналога эффекта Комптона. Такое явление в дальнейшем было названо рамановским эффектом. За открытие этого явления в 1930 г. Ч. Раману была присуждена Нобелевская премия. [1]

Неупругое рассеяние — столкновение частиц, сопровождающееся изменением их внутреннего состояния, превращением в другие частицы или дополнительным рождением новых частиц.

Неупругим рассеянием являются, например, возбуждение или ионизация атомов при их столкновениях, превращения элементарных частиц при соударениях или множественное рождение частиц. Для каждого типа неупругого рассеяния существует своя наименьшая энергия столкновения, начиная с которой возможно протекание данного процесса. Полная вероятность рассеяния при столкновении частиц складывается из вероятностей упругого рассеяния и неупругого рассеяния; при этом между упругим и неупругими процессами существует связь, определяемая оптической теоремой. [4]

Излучение, рассеиваемое молекулами, содержит фотоны той же частоты, что и падающее излучение, а также некоторое  количество  фотонов с  измененной или смещенной частотой. Спектроскопический процесс измерения этих смещенных фотонов был назван «эффект Рамана, а излучение со смещенными частотами называют Рамановским излучением. К концу 1930х гг. Рамановская спектроскопия стала ведущим методом неразрушающего химического анализа.

В Рамановской спектроскопии образец облучается монохроматическим светом. Большая часть рассеянного образцом излучения будет иметь ту же частоту, что и падающая – процесс известен как Рэлеевское рассеяние. Тем не менее, некоторое количество излучения, рассеянного образцом, примерно один фотон из миллиона – будет иметь частоту, смещенную по отношению к частоте исходного излучения лазера.

Молекула в невозбужденном состоянии находится на основном нижнем уровне. Электрическое поле лазера повышает энергию системы до нестабильного состояния, индуцируя поляризацию химических групп. Поляризованное состояние не является истинным энергетическим состоянием и называется возбужденным состоянием. Релаксация из возбужденного состояния происходит почти немедленно и в основном происходит возвращение в основное состояние. Этот процесс и является Рэлеевским рассеянием. Релаксация на первый колебательный уровень возбуждения называется Стокс-Раман сдвигом. Стокс-Раман рассеяние имеет более высокую длину волны, чем излучение лазера. Большинство систем имеют часть молекул, изначально находящихся в возбужденном колебательном состоянии. При Рамановском рассеянии такие молекулы переходят из возбужденного колебательного уровня на основной энергетический уровень, и в результате появляется излучение более короткой длины волны, чем излучение лазера. Такой тип рассеяния называется анти-Стокс- Раман сдвигом.

Не существует двух молекул, которые имеют одинаковые Рамановские спектры, а интенсивность рассеянного света связана с количеством вещества. Это позволяет просто получать количественную и качественную информацию об образце, дает возможность интерпретировать спектр, обрабатывать  данные с применением компьютерных методов количественного анализа.

Раман спектрометры основаны на одном из двух способов получения спектров: дисперсионная Раман спектроскопия или Раман спектроскопия с Фурье преобразованием. Каждый из способов имеет уникальные преимущества и идеально подходит для выполнения определенных задач.

Для получения Рамановского спектра необходимо разделить собранное рассеянное излучение на отдельные длины волн. В дисперсиионных Раман спектрометрах это выполняется фокусированием Раман сигнала на решетке, которая разделяет излучение на различные длины волн. Этот разделенный луч направляется на CCD детектор.

Дисперсионный Раман обычно использует лазеры в видимой области. Типичные длины волн лазеров 780 нм, 633 нм, 532 нм и 483 нм, но могут использоваться и другие. Одним из преимуществ использования более коротковолновых лазеров является увеличение Рамановского сигнала, которое происходит при более коротких длинах волн. Эффективность Рамановского рассеяния пропорциональна 1/λ4, поэтому происходит значительное увеличение сигнала при уменьшении длины волны излучения лазера.

На первый взгляд представляется, что Раман спектрометры должны использовать коротковолновые лазеры. Однако существует явление, которое препятствует широкой практике использования Рамановской спектроскопии – это непредсказуемая флуоресценция. Флуоресценция представляет собой сильное излучение образца, которое в несколько раз сильнее, чем Рамановский сигнал, даже незначительная флуоресценция может перекрывать исследуемый Рамановский сигнал.

Рамановская спектроскопия с Фурье преобразованием была создана для преодоления проблем, которые обычно встречаются в дисперсионной Рамановской спектроскопии. Одно из важных преимуществ Фурье-Раман спектроскопии заключается в почти полном отсутствии флуоресценции образцов. [3]

Спектр рамановского рассеяния большинства органических молекул состоит из линий, отвечающих деформационным и валентным колебаниям химических связей углерода (С) с другими элементами, как правило, водородом (H), кислородом (O) и азотом (N), а также характеристическим колебаниям различных функциональных групп (гидроксильной -OH, аминогруппы -NH2 и т.д.). Эти линии проявляются в диапазоне от 600 см-1 (валентные колебания одинарных С-С связей) до 3600 см-1 (колебания гидроксильной -OH группы). Кроме того, в спектрах органических молекул в диапазоне 250-400 см-1 проявляются деформационные колебания алифатической цепи. [2]

В отличие от ИК спектра, в котором проявляются линии, отвечающие колебательным переходам с изменением дипольного момента, в спектре Рамановского рассеивания(КР) проявляются линии, отвечающие колебательным переходам с изменением поляризуемости молекулы. Таким образом, ИК и КР являются не исключающими, а  взаимно дополняющими спектрометрическими методами.  Существуют спектрометры  КР, позволяющие одновременно в одной точке получать спектры КР и ИК.

Фурье-Раман спектрометры используют возбуждающий лазер 1 мкм, интерферометр и высоко чувствительный детектор в ближнем ИК диапазоне. При использовании возбуждающего лазера с большей длиной волны снижается энергия, поэтому виртуальное состояние ниже и меньше вероятность  наложения высоких электронных уровней. Это значительно снижает возникновение мешающей флуоресценции.

В Фурье-Раман спектроскопии используют индий, галлий, арсенид (InGaAs) детектор или охлаждаемый жидким азотом германиевый (Ge) детектор. Это очень чувствительные детекторы, но тем не менее они менее чувствительны по отношению к излучению в ближней ИК области, чем CCD детектор по отношению к видимому излучению. Для обеспечения необходимой чувствительности при получении функциональной спектральной информации из сигнала низкой чувствительности необходимы преимущества Фурье преобразования.

Фурье-Раман спектроскопия использует интерферометр для получения интерферограммы, которая «кодирует» уникальные частоты Рамановского рассеяния в единичный сигнал. Сигнал измеряется очень быстро (обычно в течение одной секунды), производя усреднение сигнала быстро и точно.

Интерферометр работает со светоделителем, оптимизированным для излучения в ближней ИК области, который делит входящее Рамановское излучение на два луча, проходящий и отраженный. Отраженный луч проходит и отражается от фиксированного плоского зеркала. Проходящий луч проходит и отражается от плоского зеркала, которое закреплено на подвижном механизме, при этом зеркало перемещается на небольшое расстояние от светоделителя.

Два луча затем рекомбинируют на светоделителе, при этом за счет разности расстояний между зеркалами лучи интерферируют. Поскольку подвижное зеркало имеет постоянную частоту и движется, то интерференция модулируется. Получаемая интерферограмма уникальна, поскольку каждая точка данных (функция положения подвижного зеркала) имеет информацию о частоте Рамановского рассеянного излучения, полученного от данного образца.

Обычно колебательные спектры представляют как спектры частот (график зависимости интенсивности при каждой индивидуальной частоте), поскольку измеренный сигнал интерферограммы не интерпретируется. Индивидуальные частоты декодируются из интерферограммы с использованием хорошо известного математического алгоритма Фурье преобразования. Это преобразование выполняет компьютер, и желаемая спектральная информация выводится на экран. [3]

Большинство органических молекул при облучении фотонами высокой энергии склонны к флуоресценции. Несмотря на то, что флуоресценция рассматривается как процесс слабого свечения, она способна подавлять сигнал  рамановского спектра. Это связано с тем, что рамановский эффект содержится в очень малой доли (примерно 1 к 107) падающих фотонов. Обычно лазеры видимого спектра используются только для анализа неорганических

Для органических молекул для снижения влияния флуоресценции без выхода за пределы спектрального диапазона детектора необходимо переключиться на длину волны ближнего ИК. Способность максимального подавления эффекта флуоресценции без сужения спектрального диапазона или разрешения делают диодные лазеры 785нм стандартными в применении в данной отрасли. Для повышения чувствительности к неорганическим молекулам следует использовать лазеры 532нм.

Вследствие всего вышесказанного, в медицине более применима Фурье-Раман спектроскопия. Так как работа с клеточным материалом в большей степени относится к органическим объектам исследования. А так как при применение дисперсионного метода будет возникать флюоресценция, подавляющая Рамановский спектр, работа с органикой будет затруднена.

 

Список литературы

1.     Горелик В.С. Комбинационное рассеяние света // Соросовский образовательный журнал. – 1997. - №6. – С.91-96.

2.     Коваленко А.А., Елисеев А.А. Спектроскопия комбинационного рассеяния // Методическая разработка Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова факультета наук о материалах. – 2011. – С. 37

3.     Компания INTERTECH Corporation. Введение в рамановскую спектроскопию // Пластические массы. – 2009. – № 8. – С. 7-13.

4.     Ландау, Л. Д., Лифшиц, Е. М. Квантовая механика (нерелятивистская теория)// Теоретическая физика — том III издание 4-е. — М.: Наука, 1989. — 768 с.